ShWRKY34启动子、关键顺式调控元件GATA-box及其应用

本发明涉及生物技术和植物基因工程领域，具体涉及一种来源于野生番茄的低温抑制型启动子shwrky34启动子及其中的一段60bp插入序列和关键顺式调控元件gata-box以及它们的应用，该启动子的一段60bp插入序列和gata-box元件能够驱动目的基因wrky34在低温胁迫条件下在番茄中表达下降，抑制低温负调控因子wrky34的表达并提高番茄低温抗性。

背景技术：

1、番茄(solanum lycopersicum l.)属于茄科(solanaceae)茄属(solanum)植物，是世界范围内广泛栽培的作物，营养价值高，具有多种用途。然而，番茄是喜温蔬菜作物，反季节设施栽培时经常遇到低温危害，导致番茄生长发育受阻，品质和产量严重降低。

2、番茄的确切起源地仍有一定的争议，但广泛的研究表明它最可能起源于南美洲安第斯山脉和邻近的热带地区。这些地区的不同气候和生态条件促进了番茄及其近缘种的多样性发展。大部分野生番茄原产于南美洲的安第斯山脉地区，该地区的高海拔和寒冷气候提供了一种选择压力，使得野生番茄逐渐适应了寒冷条件。多毛番茄(solanumhabrochaites l.)是野生番茄中抗寒性最强的一个野生种，主要分布在厄瓜多尔到秘鲁的中部海拔2000～2500m以上的地方。随着进化和驯化改良过程的进行和栽培番茄品种的出现，因为人类更多地关注其他性状(如产量、味道等)而非寒冷适应性，一些可观察到的抗寒性特征和抗寒基因位点在栽培品种中减弱甚至消失。因此，充分利用了野生抗寒番茄资源对现代栽培番茄进行遗传改良将是番茄抗寒性研究领域努力的重要方向。

3、与基因编码序列的变化不同，顺式调控区域的变化可以改变基因表达的时间、地点和数量，而不会改变其编码的蛋白质。这使得它们对于根据环境线索和发育过程微调基因表达至关重要。在进化和驯化过程中，顺式调控区域的某些变异可以赋予优势性状，如提高产量、耐受性或营养含量。越来越多的研究表明基因顺式调控区域的序列变异对作物的进化、驯化和改良起着关键作用。顺式调控区域的变异通常具有较弱的表型效应，并且避免了编码区突变所带来的多效性后果。这种变异提供了一个未充分利用的潜力空间，为未来的作物改良提供新的途径。

4、抑制型启动子可以用来通过特定化学物质或改变环境因素来抑制靶基因表达，而不是删除目的基因。抑制型启动子对于植物响应逆境来说非常有用，可以在特定环境刺激下降低某些负调控的转录本。尤其是当靶基因的基本功能影响植物基本的生长发育而不能被直接敲除时，使用环境响应的高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。目前能应用于番茄转基因抗逆研究的抑制型启动子几乎没有，对于相关逆境响应的抑制型启动子的发现、克隆、顺势调控元件分析将是今后研究的重点，将功能明确且高效的逆境抑制型启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的重要研究方向。通过对比多毛番茄和栽培番茄同源wrky基因在低温下的相对表达量，我们筛选到一对同源基因wrky34，在栽培番茄中slwrky34低温下不被诱导表达，而在多毛番茄中低温下显著抑制shwrky34表达。因此通过对上述相关的wrky34基因启动子的研究可以得到与低温胁迫抑制相关的关键dna片段和顺式调控元件，对构建有效的低温抑制型启动子有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种受低温强烈抑制表达的番茄启动子shwrky34启动子及其中的一段60bp基因片段序列和关键顺式调控元件gata-box以及它们的应用。本发明的shwrky34启动子及其中的60bp序列和关键顺式调控元件gata-box对通过抑制低温负调控因子wrky34基因在低温下的表达，来提高转基因番茄对低温的耐受性，具有重要意义。

2、第一方面，本发明提供了响应低温胁迫的抑制型启动子shwrky34启动子：

3、a)核苷酸序列如seq id no：2所示；或者，

4、b)为与a)限定的核苷酸序列具有75％以上一致性，且具有启动子功能的dna分子。

5、shwrky34启动子可从野生多毛番茄shwrky34基因启动子区域克隆得到。

6、第二方面，本发明提供了含有第一方面所述的抑制型启动子shwrky34启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

7、第三方面，本发明提供了第一方面所述的抑制型启动子shwrky34启动子在提高番茄抗冷性中的应用。

8、第四方面，本发明提供了响应低温胁迫的基因片段(60bp插入序列)，核苷酸序列如seq id no：7所示。

9、第五方面，本发明提供了含有第四方面所述的基因片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

10、第六方面，本发明提供了第四方面所述的基因片段在提高番茄抗冷性中的应用。

11、第七方面，本发明提供了响应低温胁迫的关键顺式调控元件gata-box，核苷酸序列如seq id no：8所示。

12、第八方面，本发明提供了含有第七方面所述的关键顺式调控元件gata-box的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

13、第九方面，本发明提供了第七方面所述的关键顺式调控元件gata-box在提高番茄抗冷性中的应用。

14、本发明中，wrky34基因具有负调控番茄植株抗冷性的功能，所述wrky34基因的核苷酸序列如seq id no：9所示。

15、在烟草瞬时表达的启动子活性分析实验中，我们发现低温可以显著抑制shwrky34启动子、插入了60bp序列的slwrky34启动子响应低温，而不会抑制slwrky34启动子响应低温。同时，60bp内的顺式调控元件w-box突变的shwrky34启动子同样可以在低温下被抑制，而60bp内的顺式调控元件gata-box突变的shwrky34启动子失去了响应低温的功能。此外，低温也可以显著抑制插入了包含gata-box的30bp的slwrky34启动子。本发明提供了上述启动子及其中的一段60bp插入序列和关键顺式调控元件gata-box在培育抗寒番茄中的应用，以改良番茄品种的抗寒性能。因此，本发明为培育耐低温番茄新品种提供了理想启动子和调控靶点，具有较好的潜在应用价值。

16、本发明与现有技术相比，有益效果有：

17、本发明通过对野生多毛番茄和栽培番茄的wrky34基因启动子进行研究，发现了受低温抑制的shwrky34启动子、shwrky34启动子的一段60bp插入序列和shwrky34启动子的关键顺式调控元件gata-box，为构建有效的低温抑制型启动子提供了基础。

技术特征：

1.响应低温胁迫的抑制型启动子shwrky34启动子，其特征在于，核苷酸序列如seq idno：2所示。

2.含有如权利要求1所述的抑制型启动子shwrky34启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

3.如权利要求1所述的抑制型启动子shwrky34启动子在提高番茄抗冷性中的应用。

4.响应低温胁迫的基因片段，其特征在于，核苷酸序列如seq id no：7所示。

5.含有如权利要求4所述的基因片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

6.如权利要求4所述的基因片段在提高番茄抗冷性中的应用。

7.响应低温胁迫的关键顺式调控元件gata-box，其特征在于，核苷酸序列如seq idno：8所示。

8.含有如权利要求7所述的关键顺式调控元件gata-box的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。

9.如权利要求7所述的关键顺式调控元件gata-box在提高番茄抗冷性中的应用。

技术总结
本发明公开了一种响应低温胁迫的抑制型启动子ShWRKY34启动子及其中的基因片段和关键顺式调控元件GATA‑box，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。本发明公开了上述基因序列在提高番茄抗冷性、培育抗寒番茄中的应用。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了理想启动子和调控靶点，具有较好的潜在应用价值。

技术研发人员：周杰,郭明月,喻景权
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16