一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的CAR-M及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，更具体的，涉及一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m及其制备方法和应用。

背景技术：

1、癌症是世界范围内的主要公共卫生问题，是导致死亡的主要原因之一。复杂的发病机制、难控制的高危因素使得对肿瘤的预防具有高难度。而传统的肿瘤治疗方法都其各自的局限性。手术不能完全切除肿瘤组织，复发率高；化疗往往对肿瘤细胞缺乏选择性，对正常器官造成严重的副作用且化疗药物耐药性的产生也极大地限制了其应用；放疗常损伤癌细胞附近的健康细胞和组织。因此，寻找切实有效的肿瘤治疗方法至关重要。

2、嵌合抗原受体(car)免疫疗法的过继细胞疗法取得了巨大进展，美国食品药品监督管理局(fda)批准了八种用于血液系统恶性肿瘤的car-t疗法。尽管一些血液系统恶性肿瘤已经很容易通过car-t治疗，但实体瘤的car免疫疗法明显滞后。与血液系统恶性肿瘤(允许疾病进入外周血、骨髓、淋巴结或脾脏)不同，实体瘤需要主动运输、外渗和渗透到通常免疫力和致密的纤维化肿块中。发育中的肿瘤限制了t细胞的募集和浸润，激活了广泛的抑制途径以限制t细胞活化，并表现出异质性肿瘤相关抗原的表达。在实体瘤中，car免疫治疗的一些主要障碍包括car-t细胞制造，缺乏肿瘤特异性抗原，低效的car-t细胞运输和浸润到肿瘤部位，免疫抑制肿瘤微环境(tme)，治疗相关毒性和抗原逃逸。绝大多数情况下，car-t的全身治疗导致疗效有限或反应短暂。因此，人们已经做出了许多努力来创建car疗法的改进迭代，以克服坚实的肿瘤免疫微环境带来的挑战。

3、近年来，在将car平台从t细胞扩展到替代白细胞方面取得了重大进展，除了t细胞外，car设计还可以引入其他免疫细胞中，例如巨噬细胞、nk/nkt细胞、γδ-t细胞、粘膜相关不变t(mait)细胞、树突状细胞(dc)、调节性t细胞(treg)、b细胞等，与传统的car-t相比，这些淋巴细胞可能可以提供更好的安全性或治疗潜力。而巨噬细胞在克服阻碍car-t的实体瘤治疗障碍中表现得极具潜力。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是浸润率最高的先天免疫细胞。巨噬细胞可以通过促炎和抗炎的方式影响周围的免疫细胞，并且擅长重塑细胞外基质(ecm)。巨噬细胞是先天免疫细胞，具有强大的吞噬和细胞毒性能力，可通过t细胞募集、抗原呈递、共刺激和细胞因子分泌启动和增强适应性免疫应答。由于巨噬细胞可以浸润实体肿瘤组织并与肿瘤微环境中几乎所有的细胞成分(包括肿瘤细胞、免疫细胞如t细胞、nk细胞、dc和其他常驻非免疫细胞)相互作用，因此，在实体瘤中开发用于癌症免疫治疗的car巨噬细胞以克服car-t/nk治疗相关的一些主要障碍是具有很广的应用前景的。

4、然而，目前的研究表明，car-巨噬细胞在应用过程中有自身存在的局限性。不像t细胞、nk细胞可以在体外大量扩增成千上万倍，巨噬细胞在体外和输入体内后是不增殖的。一个病人一次最多能获得的巨噬细胞很有限，从而可能会严重限制其治疗效果。此外，巨噬细胞天然对常用的病毒载体具有抗性。巨噬细胞是人体抗击癌细胞和病毒的第一道防线，这一特性也让通过改造巨噬细胞来攻击癌症面临着难题，这类细胞会对常用的标准病毒载体产生抗性，导致病毒载体无法感染巨噬细胞。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m及其制备方法和应用。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m，制备方法如下：

4、s1、分别合成anti-cd206-lamp2、cd63-l7ae和anti-msln car-c/d box；序列分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3所示；

5、s2、构建分别含有anti-cd206-lamp2、cd63-l7ae和anti-msln car-c/d box的质粒，并将质粒分别与pspax2和pmd2.g包装质粒共转染细胞获得三种对应的慢病毒；

6、s3、将编码这三种目的蛋白的慢病毒依次转染细胞，以获得稳转细胞株；稳定表达的细胞在含有去除了外泌体的培养基中扩增，后分离出外泌体即为巨噬细胞靶向的外泌体，然后可用该外泌体介导car-m的生成。

7、在这里，我们提出了一种简单的方法，利用外泌体工程化巨噬细胞。利用装载有编码car的基因序列的巨噬细胞靶向外泌体，能在体内或体外诱导car-巨噬细胞的生成，实现car介导的肿瘤细胞吞噬增强、抗肿瘤免疫调节和抑制实体肿瘤生长，具有广阔的应用前景。

8、优选地，所述分别含有anti-cd206-lamp2、cd63-l7ae和anti-msln car-c/d box的质粒，与pspax2和pmd2.g包装质粒的混合比例为4:3:1。

9、利用外泌体靶向巨噬细胞，以构建具有抗肿瘤效果的car-巨噬细胞，实现对肿瘤的高效浸润，对肿瘤细胞的高效识别吞噬，对t细胞的抗原呈递，促进免疫细胞的激活，促炎细胞因子的释放，诱导免疫记忆，实现免疫微环境的重塑以及肿瘤细胞的特异性杀伤并防止肿瘤复发。

10、因此，本发明还提供所述巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m在制备抗肿瘤药物中的应用。

11、更优选地，所述肿瘤为肺转移性肿瘤。

12、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

13、本发明提供了一种基因工程修饰的外泌体，外泌体能靶向巨噬细胞，其内装载有car基因，能靶向递送其内的car基因给巨噬细胞实现car-巨噬细胞的体内外编辑。

14、由该工程化外泌体在体内外制备的car-m具有增强的抗原依赖的肿瘤细胞吞噬作用，能诱导巨噬细胞相促炎表型极化，促进促炎细胞因子的分泌，能发挥很好的抗原呈递作用，促进免疫细胞活化。

15、该基因工程化外泌体在应用与肿瘤的治疗过程中，能靶向巨噬细胞，实现瘤内car-巨噬细胞的基因编辑，重塑肿瘤微环境，实现肿瘤的高效杀伤，并诱导免疫记忆，防止肿瘤复发。

16、car-m传统的制备过程包括单核/巨噬细胞的分离、巨噬细胞的诱导、腺病毒的感染和car-m的回输等过程，制备过程极其复杂且周期长。为了避免免疫排斥，car-m细胞的需要专人专机培养，因此难以实现规模化生产。为了克服以上缺点，本发明公布了一种通过工程化外泌体直接生产car-m的方法。本发明这种工程化外泌体不仅可以在体外直接生产car-m，经雾化吸入等方式给药后还可以直接在体内生成car-m，因此大幅降低了car-m的制备周期。

技术特征：

1.一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m，其特征在于，制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m，其特征在于，所述分别含有anti-cd206-lamp2、cd63-l7ae和anti-msln car-c/d box的质粒，与pspax2和pmd2.g包装质粒的混合比例为4:3:1。

3.权利要求1或2所述巨噬细胞靶向的外泌体介导的car-m在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺转移性肿瘤。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种巨噬细胞靶向的外泌体介导的CAR‑M及其制备方法和应用。该外泌体能靶向巨噬细胞，因此可以将负载的CAR基因靶向递送至巨噬细胞，进而将巨噬细胞编辑成CAR‑巨噬细胞。由该工程化外泌体在体内外制备的CAR‑M具有增强的抗原依赖的肿瘤细胞吞噬作用，能诱导巨噬细胞向促炎表型极化，促进促炎细胞因子的分泌，能发挥很好的抗原呈递作用，促进免疫细胞活化。该基因工程化外泌体在应用于肿瘤的治疗过程中，能靶向巨噬细胞，实现将瘤内的巨噬细胞编辑成CAR‑巨噬细胞，重塑肿瘤微环境，实现肿瘤的高效杀伤，并诱导免疫记忆，防止肿瘤复发。

技术研发人员：黄曦,肖雨晨
受保护的技术使用者：钦源再生医学（广东）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6