一种特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母的适配体及其应用的制作方法

本发明属于适配体生物，涉及一种特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母的适配体及其应用。

背景技术：

1、传统固态白酒的发酵是一个复杂的多种微生物生物转化的过程,酵母在其中起着重要作用。酿酒酵母主要功能为酒精发酵，具有较高的发酵速率和完全的发酵能力，而毕赤酵母作为最重要的一类非酿酒酵母，能够合成多种酶，并将原料中的前体物质转换成风味物质如酯、酸、高级醇和醛等产物，对发酵食品(尤其是酒类)风味、质地和色泽的形成有着重要的作用。此外，毕赤酵母还能抑制发酵过程中一些腐败微生物的繁殖，促进酵母的代谢性能，从而最终改变发酵产物的风味特征。因此，毕赤酵母的特异性分析对于酿造食品的生产具有重要意义。

2、目前，对于毕赤酵母的特异性识别分析方法主要包括培养法和分析生物学法。前者通常要经过分离培养、菌液配置等一系列操作，至少需要8-24h才能得到相应的结果。而最新的分子生物学技术如微阵列技术、dna芯片、聚合酶链反应(polymerase chainreaction，pcr)等方法，虽然灵敏度和特异性较好，但有着较为苛刻的时间条件并需要专业性好的操作人员开展，加之耗材较为昂贵，目前应用较少。

3、适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(selex)对人工合成的随机核苷酸序列文库进行体外筛选后获得的、能够特异性识别结合靶标的一段短的单链核苷酸序列，具有筛选周期短、亲和性高、特异性好、靶标范围广且成本低廉等显著优点。与抗体相比合成方便、易于修饰、性能稳定且易于保存。这些特点使得适配体在药物递送、医学诊断、食品安全等领域具有无可匹敌的优势且己被广泛用作各类生物传感器的识别元件。

4、基于此，本发明旨在提供一种可以特异性识别毕赤酵母的核酸适配体。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种可以特异性识别毕赤酵母的核酸适配体。本发明所提供的核酸适配体对库德里阿兹威氏毕赤酵母具有较强的识别特异性和亲和力，可以解决现有的生物学检测技术不能快速富集库德里阿兹威氏毕赤酵母并后续进行准确检测的问题。

2、根据本发明的第一方面，本发明提供了一种特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母的核酸适配体，所述适配体的核苷酸序列包括：

3、如seq id no.1所示的核苷酸序列；和/或

4、如seq id no.2所示的核苷酸序列；和/或

5、如seq id no.3所示的核苷酸序列。

6、在一些实施方案中，所述核酸适配体包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、疏基化或同位素化。

7、在一些实施方案中，所述核酸适配体包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇或叶酸标记。

8、在一些实施方案中，所述核酸适配体包括：具有所述如seq id no.1所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

9、在一些实施方案中，具有所述如seq id no.2所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

10、在一些实施方案中，具有所述如seq id no.3所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

11、在一些实施方案中，所述的核酸适配体的筛选方法，包括如下步骤：随机寡核苷酸文库的建立、亲和性筛选、扩增和克隆测序。

12、根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种磁性粒子，包含所述的核酸适配体。

13、在一些实施方案中，一种所述磁性粒子的制备方法，包括：通过将链霉亲和素固定在聚合物磁性微球上制备得到的链霉亲和素磁珠与所述核酸适配体混合、反应，所述所述磁性粒子。

14、根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的核酸适配体在特异性识别和/或富集和/或检测库德里阿兹威氏毕赤酵母中方面的应用。

15、根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种如本发明第二方面所述的磁性粒子在特异性识别和/或富集和/或检测库德里阿兹威氏毕赤酵母中方面的应用。

16、根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种库德里阿兹威氏毕赤酵母的特异性识别方法，所述方法包括：

17、将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母与本发明第一方面任一所述的核酸适配体或/与本发明第二方面任一所述的磁性粒子进行混合、孵育，即可实现所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的特异性识别。

18、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

19、(1)本发明所提供的核酸适配体序列nec52、nec83和nec88能够特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母，亲和力和特异性均较强，且具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势。

20、(2)其次，本发明提供的核酸适配体还可以利用其与磁性纳米颗粒结合达到富集库德里阿兹威氏毕赤酵母的目的，且通过本发明所提供的核酸适配体序列nec52、nec83和nec88与磁性纳米颗粒结合，对库德里阿兹威氏毕赤酵母具有较好的富集捕获效果。

技术特征：

1.一种特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括：如seq id no.1所示的核苷酸序列；和/或

2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，在所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、疏基化或同位素化。

3.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，在所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇或叶酸标记。

4.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，具有所述如seq id no.1所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

5.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，具有所述如seq id no.2所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

6.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，具有所述如seq id no.3所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎。

7.一种磁性粒子，其特征在于，包含如权利要求1-6任一所述的核酸适配体。

8.一种如权利要求6所述磁性粒子的制备方法，其特征在于，包括：通过将链霉亲和素固定在聚合物磁性微球上制备得到的链霉亲和素磁珠与所述核酸适配体混合、反应，得到所述磁性粒子。

9.一种如权利要求1-6任一所述的核酸适配体/或如权利要求7所述的磁性粒子在特异性识别和/或富集和/或检测库德里阿兹威氏毕赤酵母方面的应用。

10.一种库德里阿兹威氏毕赤酵母的特异性识别方法，其特征在于，所述方法包括：

技术总结
本发明属于适配体生物技术领域，涉及一种特异性识别库德里阿兹威氏毕赤酵母的适配体及其应用。所述适配体的核苷酸序列包括：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；和/或，如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明应用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，以库德里阿兹威氏毕赤酵母为靶标，经过多轮筛选、以及亲和力、特异性试验的分析验证，最终筛选得到一组对库德里阿兹威氏毕赤酵母具有较好亲和性和特异性的核酸适配体，可将其用于库德里阿兹威氏毕赤酵母的快速富集以及检测领域。

技术研发人员：王莉,陈良强,滕梦静,黄婉秋,杨帆,卢建军,吕锡斌,余绍宁,沈昊
受保护的技术使用者：贵州茅台酒股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/26