一种TRV病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法

本发明属于病毒诱导的基因沉默，具体涉及一种trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。vigs是根据植物对rna病毒防御机制发展起来的一种用于表征植物基因功能的基因转录技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(post-transcript genesilence).与传统的基因功能分析方法相比，vigs技术具有时间短、见效快、操作简单等优点，且不需要遗传转化就能获得基因沉默植株，已成为研究基因功能强有力的技术之一。该技术已广泛应用于植物生长发育、抗病虫、逆境胁迫、信号传导、代谢调控等基因功能研究中。

2、菠菜(spinacia oleracea l)，藜科波菜属一二年生草本绿叶类蔬菜，其口感清脆，含有较高的蛋白质等营养物质，其叶中含有的铬和一种类胰岛素物质，能使人血糖保持稳定，具有食疗都作用。然而目前，菠菜尚未建立一套稳定成熟的遗传转化体系，严重阻碍了该物种的基因功能及相关机理性的研究，因此一种高效、快速的遗传转化方法是研究菠菜基因功能的重要技术突破。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供了一种trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，该方法为开展菠菜基因功能的研究提供了新路径。

2、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于具体步骤为：

3、步骤s1：构建含有内源目标基因的ptrv2病毒沉默表达载体重组质粒，并将其转入根癌农杆菌得到转入重组质粒的阳性农杆菌，该重组质粒的核苷酸序列如seq id no.2所示；

4、步骤s2：利用转入重组质粒的阳性农杆菌制备vigs侵染液，通过压力注射方式将阳性农杆菌接种至菠菜叶片；

5、步骤s3：将注射好的菠菜幼苗避光培养24h后，在18℃、16h光照/8h黑暗条件下继续培养得到沉默目标基因的菠菜植株。

6、进一步的，步骤s2中接种菠菜的苗龄为长出四片真叶。

7、进一步的，步骤s2中vigs侵染液中转入重组质粒的阳性农杆菌浓度为od600＝1.5。

8、进一步的，步骤s1的具体过程为：

9、步骤101：提取菠菜花的总rna，进行反转录得到cdna；

10、步骤102：在菠菜基因组数据中调取目标基因的cds序列，比对，筛选出100-500bp长度的目标基因特异性片段；

11、步骤103：根据目标基因特异性片段设计扩增引物，该扩增引物序列如下所示：

12、sppds-vigs-f:gaattcttatgaccatctactattc

13、sppds-vigs-r:ggatcctccattcttctgcaggtgca

14、以步骤101中的cdna为模板进行pcr扩增得到目标基因片段即sppds基因片段，该sppds基因片段的基因序列如seq id no.1所示；

15、步骤s104：将步骤s103得到的sppds基因片段和ptrv2载体在双酶切反应体系中分别进行双酶切，双酶切完成后对sppds基因片段和ptrv2载体进行切胶回收；

16、步骤s105：使用t4连接酶，通过粘性末端连接的方法将sppds基因片段与ptrv2载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态，挑单克隆检测正确后，提取重组质粒ptrv2-sppds并通过热激法转入根癌农杆菌。

17、进一步的，所述pcr扩增的反应条件为95℃2min；95℃20s，55℃20s，72℃10s，40个循环；72℃5min。

18、进一步的，所述双酶切反应体系为：

19、

20、双酶切反应条件为：37℃30min；80℃5min。

21、进一步的，所述构建重组质粒ptrv2-sppds的反应体系为：

22、

23、

24、其中x:y＝1:1～1:5。

25、进一步的，所述转入根癌农杆菌的具体过程为：融化10μl农杆菌gv3101感受态细胞；加入1μl重组质粒，充分混匀，并于冰上静置5min；将离心管迅速放入液氮中速冻5min；取出并放入37℃水浴热激5min；取出置于冰上冰浴5min；每管加入700μl的lb培养基，在28℃、200rpm的条件下振荡培养3h，使质粒复苏；以6000rpm的转速离心1min收集细胞沉淀，用100μl lb液体重悬菌体，均匀涂布在附加100mg·l-1卡那霉素、50mg·l-1利福平的lb固体培养基上，于28℃倒置培养36-48h。

26、进一步的，步骤s2的具体过程为：

27、步骤s201：将转入重组质粒的阳性农杆菌单菌落接种至含有100mg·l-1卡那霉素和50mg·l-1利福平的lb液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下震荡培养12h；

28、步骤s202：将步骤s201得到的菌液按照体积比1:20接种至含有100mg·l-1卡那霉素和50mg·l-1利福平的新鲜lb液体培养基中，在28℃、200rpm的条件下震荡培养16h至od600＝1.3-2.0；

29、步骤s203：将步骤s202得到的菌液在4℃、3500rpm的条件下离心12min，弃上清后使用mmabuffer重悬菌体至od600＝1.5，再于25℃避光静置3h得到ptrv2-sppds菌液；

30、步骤s204：分别制备转入ptrv1和ptrv2空载的农杆菌，用步骤s201-203的方法制备相同浓度的ptrv1菌液和ptrv2空载菌液；

31、步骤s205：将ptrv2-sppds菌液与ptrv1菌液按体积比1:1混匀制备得到vigs侵染液；

32、步骤s206：将vigs侵染液从菠菜叶片背面注入至整个叶片湿润，注射菠菜的所有完全展开叶。

33、本发明具有以下优点和有益效果：本发明将含有内源目标基因片段的ptrv2病毒沉默表达载体，借助叶片注射法转化菠菜，使菠菜内源目标基因发生沉默。本发明建立了一种trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的技术体系。

技术特征：

1.一种trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于具体步骤为：

2.根据权利要求1所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：步骤s2中接种菠菜的苗龄为长出四片真叶。

3.根据权利要求1所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：步骤s2中vigs侵染液中转入重组质粒的阳性农杆菌浓度为od600＝1.5。

4.根据权利要求1所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于步骤s1的具体过程为：

5.根据权利要求4所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：所述pcr扩增的反应条件为95℃2min；95℃20s，55℃20s，72℃10s，40个循环；72℃5min。

6.根据权利要求4所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：所述双酶切反应体系为：

7.根据权利要求4所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：所述构建重组质粒ptrv2-sppds的反应体系为：

8.根据权利要求4所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于：所述转入根癌农杆菌的具体过程为：融化10μl农杆菌gv3101感受态细胞；加入1μl重组质粒，充分混匀，并于冰上静置5min；将离心管迅速放入液氮中速冻5min；取出并放入37℃水浴热激5min；取出置于冰上冰浴5min；每管加入700μl的lb液体培养基，在28℃、200rpm的条件下振荡培养3h，使质粒复苏；以6000rpm的转速离心1min收集细胞沉淀，用100μl lb液体培养基重悬菌体，均匀涂布在附加100mg·l-1卡那霉素、50mg·l-1利福平的lb固体培养基上，于28℃倒置培养36-48h。

9.根据权利要求1所述的trv病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，其特征在于步骤s2的具体过程为：

技术总结
本发明公开了一种TRV病毒诱导菠菜内源基因沉默的方法，构建含有内源目标基因的pTRV2病毒沉默表达载体重组质粒，并将其转入根癌农杆菌得到转入重组质粒的阳性农杆菌；利用转入重组质粒的阳性农杆菌制备VIGS侵染液，通过压力注射方式将阳性农杆菌接种至菠菜叶片；将注射好的菠菜幼苗避光培养24h后，在18℃、16h光照/8h黑暗条件下继续培养得到沉默目标基因的菠菜植株。本发明将含有内源目的基因片段的pTRV2病毒沉默表达载体，借助叶片注射法转化菠菜，使菠菜内源目标基因发生沉默。

技术研发人员：李宁,王元伸,刘梦雨,邓传良
受保护的技术使用者：河南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12