一种烟草低温响应基因NtSAP9及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及烟草低温响应基因ntsap9及其应用。

背景技术：

1、烟草(nicotiana tabacum l.)，原产于热带及亚热带地区，是一种重要的叶用经济作物及模式生物，易受低温胁迫，最适生长温度为25-28℃，低温条件下烟草生长受阻、品质和产量下降。苗期烟草更易受到低温胁迫的影响，6～7叶苗龄的烟草幼苗如果遭受12℃低温胁迫两周就会导致烟草出现早花现象，降低烟叶产量与品质，给农业生产及烟农造成巨大的经济损失。因此，综合利用分子生物技术手段挖掘烟草耐低温基因，开发分子标记，实现烟草品种定向改良，培育耐低温烟草新品种，已成为一种目前培育优异种质资源不可或缺的方法途径。

2、胁迫相关蛋白(stress associated proteins,saps)，是一类n端为a20结构，c端为an1结构的广泛参与植物逆境胁迫的锌指蛋白。目前有关saps蛋白的研究主要集中在植物领域，已有大量研究表明，saps蛋白的表达与植物非生物胁迫响应相关。依据a20/an1锌指蛋白类型和数量的差异可将植物中的saps蛋白可分为两个大类：包含a型(1个a20结构域+1个an1结构域)、b型(1个a20结构域+1个不完整的an1结构域)、c型(只有1个an1结构域或1个an1结构域+2个a20结构域)3个亚类的ⅰ类以及含有两个an1结构域的ⅱ类。研究发现，当逆境来临时sap基因能迅速做出响应，提高植物对非生物胁迫的耐受能力，保证植物在逆境条件下也能够较为正常的生长。ossap1是植株中最早研究的一个sap蛋白家族成员，其受aba、低温、高温、干旱、高盐及重金属等多种胁迫的诱导，在烟草中过表达该基因，显著提高了烟草萌发期及烟草幼苗对低温、干旱及高盐的耐受性。此外，从拟南芥中鉴定出的atsap5、atsap10、atsap12、atsap13，玉米zman13，小麦tasap1、tasap2，大豆gmsap16，苜蓿属mtsap1，甘蔗shsap1以及香蕉musasap1等植物中的saps家族均已被证明参与植物多种逆境胁迫过程。sap蛋白除在植物逆境胁迫中发挥作用外，它们还参与调控植物的生长发育过程。例如在外源赤霉素(ga)的诱导作用下，过表达水稻osdog基因的植株表现出植株矮小、穗长变短、籽粒变小的特征。

3、目前有关sap蛋白调控植物逆境胁迫的作用机制尚不是非常清楚，根据已有的研究结果推测，其可能的作用机制主要包括三种方式：(1)作为转录因子调控下游抗逆效应基因的表达：ben-saad等发现，在烟草中过表达獐毛alsap基因可显著提高逆境条件下活性氧清除系统和渗透调节相关基因家族的表达水平。(2)参与泛素蛋白酶途径：saps蛋白介导细胞内的泛素蛋白酶途径，通过26s蛋白酶复合体识别和降解靶蛋白。穿梭蛋白rad23d具有可以将泛素化底物转移到26s蛋白酶体上降解的作用，而拟南芥atsap9可与rad23d发生相互作用，因此推测拟南芥atsap9可能参与了泛素化蛋白酶的过程。(3)通过蛋白互作发挥功能：植物遭受外界非生物胁迫伤害后，将所产生的信号传递至胞内蛋白激酶(如类受体胞质蛋白激酶rlck)，接收到信号的蛋白激酶与sap蛋白互作，活化sap蛋白功能，活化后的sap蛋白继续识别并于其他蛋白发生相互作用，调控下游相关抗逆基因的表达。水稻ossap11与osrlck253在核膜及质膜处发生相互作用，与对照相比过表达这两个基因的株系表现出更强的干旱和高盐耐性(giri j,vij s,dansana p k,et al.rice a20/an1 zinc-fingercontaining stress-associated proteins(sap1/11)and a receptor-like cytoplasmickinase(osrlck253)interact via a20 zinc-finger and confer abiotic stresstolerance in transgenic arabidopsis plants[j].new phytologist,2011,191(3):721-732.)。目前关于烟草中saps基因的挖掘及功能研究还少有报道，白戈等(2018)克隆了烟草中锌指蛋白基因ntsap5，发现该基因ntsap5的表达受干旱胁迫调控，在干旱胁迫下表达量先升高，后缓慢降低,过表达ntsap5的转基因植株比非转基因植株具有较强的抵御干旱胁迫能力(白戈,杨大海,姚恒,等.烟草ntsap5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定[j].烟草学报,2019,25(2):74-77.)。但saps基因在烟草低温响应基因方面的研究还未见报道。

技术实现思路

1、本发明人基于rna-seq数据分析，从烟草鉴定到一个显著受低温诱导的基因ntsap9。并对该基因开展了功能鉴定及其调控机制解析，为烟草耐低温分子育种提供基因资源和理论基础，进而完成本发明。

2、本发明提供一种低温响应基因ntsap9，其编码如seq id no：2所示氨基酸序列，或与其具有95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上的同一性的氨基酸序列的同源基因，且具有相同的功能并来源于烟草。

3、具体地，其是基因组基因或cds核酸，优选地其核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明也提供由所述的低温响应基因ntsap9编码的蛋白，优选地其氨基酸序列如seq id no：2所示。

5、本发明还提供含有所述的低温响应基因ntsap9的表达载体、重组宿主细胞。

6、本发明尤其提供所述的低温响应基因ntsap9在影响植物耐低温性育种中的应用。

7、具体地，在植物中敲除所述低温响应基因ntsap9或其同源基因以获得低温敏感性性提高的植物，或在植物中过表达所述低温响应基因ntsap9以获得耐低温性提高的植物；所述植物选自单子叶植物、双子叶植物，优选地，所述植物为烟草。

8、本发明还提供一种培育耐低温性提高的转基因植物的方法，其是将含有如权利要求1或2所述的低温响应基因ntsap9过表达载体转化植物获得转基因植物的步骤；所述选自单子叶植物、双子叶植物，优选地，所述植物为烟草。

9、进一步地，还包括鉴定所述转基因植物的低温耐受性的步骤，任选还包括进一步种植获得纯种的步骤。

10、具体地，所述转化植物是农杆菌介导法、基因枪法。

11、本发明提供的ntsap9基因受低温胁迫显著诱导，其含锌指a20和an1结构域的胁迫相关蛋白。其启动子区域具有多种顺式作用元件，包含了低温诱导和脱落酸响应元件。过表达ntsap9基因能够增强烟草低温耐受性，而抑制该基因表达则植物低温耐受性降低，说明该基因正调控烟草低温耐受性。因此，本发明提供的所述基因尤其可以用于通过基因工程技术快速、精准培育烟草耐低温品种，具有应用价值。

技术特征：

1.一种低温响应基因ntsap9，其特征在于，其编码如seq id no：2所示氨基酸序列，或与其具有95%以上，96%以上，97%以上，98%以上，99%以上的同一性的氨基酸序列的同源基因，且具有相同的功能并来源于烟草。

2.如权利要求1所述的低温响应基因ntsap9，其特征在于，其是基因组基因或cds核酸，优选地其核苷酸序列如seq id no：1所示。

3.由如权利要求1或2所述的低温响应基因ntsap9编码的蛋白。

4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：2所示。

5.含有如权利要求1或2所述的低温响应基因ntsap9的表达载体、重组宿主细胞。

6.如权利要求1或2所述的低温响应基因ntsap9在影响植物耐低温性育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在植物中敲除所述低温响应基因ntsap9或其同源基因以获得低温敏感性性提高的植物，或在植物中过表达所述低温响应基因ntsap9以获得耐低温性提高的植物；所述植物选自单子叶植物、双子叶植物，优选地，所述植物为烟草。

8.一种培育耐低温性提高的转基因植物的方法，其特征在于，将含有如权利要求1或2所述的低温响应基因ntsap9过表达载体转化植物获得转基因植物的步骤；所述选自单子叶植物、双子叶植物，优选地，所述植物为烟草。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括鉴定所述转基因植物的低温耐受性的步骤，任选还包括进一步种植获得纯种的步骤。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述转化植物是农杆菌介导法、基因枪法。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草低温响应基因NtSAP9及其应用。本发明基于RNA‑Seq数据分析，从烟草鉴定到显著受低温诱导的基因Cold5。基因功能鉴定结果表明，在烟草中过量表达所述基因提高了转基因植株的低温耐受性，而通过病毒介导的基因沉默技术沉默烟草内源的所述基因则导致低温耐受性降低，说明NtSAP9正调控植物的低温耐受性。本发明提供的所述基因可以用于通过基因工程技术快速、精准培育烟草耐低温品种，具有应用价值。

技术研发人员：户正荣,胡日生,黄雪冰,任晓敏,向世鹏,李洋洋,李瑾洁,姜习振,唐浩存,尹慧,朱露萍
受保护的技术使用者：中国烟草总公司湖南省公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6