一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用与流程

本申请属于基因工程领域，具体涉及一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、再生障碍性贫血是一种骨髓造血功能衰竭导致红细胞以及全血细胞减少为特征的血液系统疾病。目前已知的再生障碍性贫血的发病原因主要分为两类：一类是物理、生物或化学毒物，如放射线、病毒、细菌或某些药物等；另外一类是遗传因素，这一类也称为先天性再障，如fanconi贫血、先天性角化不良以及schwachman-diamond综合征。除以上因素以外，超过半数的再生障碍性贫血患者无明显病因可查。其中，再生障碍性贫血的治疗主要包括支持治疗和目标治疗两方面，支持治疗主要目的是预防和治疗血细胞减少。再生障碍性贫血可以根据病情、血象、骨髓象及预后分为重型和非重型。其中，重型若不积极治疗，容易发生感染和出血等，并最终导致死亡。

2、目前已被报道的相关的致病基因包括dkc1、terc、tert、nhp2、nop10、ctc1、wrap53、tinf2、acd、parn、rtel1、usb1、tcab1、pot1、tpp1、wrd79、tr、nola2、nola3等几十个，同时还不断有新的致病基因被发现。如此多样的致病基因对应着复杂的致病机制，但目前已经构建的遗传性再障动物模型仅仅是针对其中的sbds、fanca等有限的几个，不足以揭示再障发生机制的多样性，同时也不能满足针对不同再障机制的药物筛选的需求。

3、因此，有必要探寻并构建新基因的再生障碍性贫血症动物模型。

技术实现思路

1、基于此，本申请一实施例提供一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法及应用。

2、本申请一方面提供一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，包括：

3、制备靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna，所述sgrna的序列如seq idno.1所示。

4、混合所述sgrna与cas9蛋白，制备cas9/sgrna混合物。

5、将所述cas9/sgrna混合物引入野生型斑马鱼胚胎中，获得f0代斑马鱼。

6、将所述f0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配，从出生的斑马鱼中筛选出阳性杂合子f1代斑马鱼作为再生障碍性贫血症斑马鱼模型。

7、在其中一个实施例中，采用显微注射的方式将所述cas9/sgrna混合物引入野生型斑马鱼胚胎。

8、在其中一个实施例中，采用pcr法和sanger测序法筛选出阳性杂合子f1代斑马鱼，所述pcr法采用如seq id no.4~seq id no.5所示的检测引物对。

9、本申请还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的组织。

10、本申请另一方面提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的器官。

11、本申请另一方面提供特异靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.1所示。

12、本申请另一方面提供一种构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，包含靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna；所述sgrna的序列如seq id no.1所示。

13、在其中一个实施例中，还包括cas9蛋白、pcr反应缓冲液和pcr反应液中的一种或多种。

14、在其中一个实施例中，所述pcr反应液包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

15、本申请还提供上述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法制备的再生障碍性贫血症斑马鱼模型在高通量药物筛选中的应用。

16、本申请提供的再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法构建了一种新的再生障碍性贫血的斑马鱼模型，通过crispr/cas9系统针对ddx10基因进行基因编辑，设计靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna，获得了ddx10敲除的斑马鱼突变体，该再生障碍性贫血症斑马鱼模型与人类再生障碍性贫血患者的症状十分相似，不仅可以用于研究再生障碍性贫血的发生机制，还可以用于相关治疗药物的筛选。本申请的构建方法不仅为再障的机制研究提供了新的动物模型，有助于揭示新的发生机制，还为再障的药物筛选提供了一个稳定、活体、重复性好、成本低的动物模型。

技术特征：

1.一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，采用显微注射的方式将所述cas9/sgrna混合物引入野生型斑马鱼胚胎。

3.根据权利要求2所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，采用pcr法和sanger测序法筛选出阳性杂合子f1代斑马鱼；

4.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的组织。

5.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法建立的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的器官。

6.特异靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.1所示。

7.一种构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，包含靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgrna；

8.根据权利要求7所述的构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，还包括cas9蛋白、pcr反应缓冲液和pcr反应液中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的构建再生障碍性贫血症斑马鱼模型的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

10.权利要求1~3任一项所述的再生障碍性贫血症斑马鱼模型的构建方法制备的再生障碍性贫血症斑马鱼模型在高通量药物筛选中的应用。

技术总结
本申请属于基因工程领域，具体涉及一种再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法及应用。本申请提供的再生障碍性贫血症斑马鱼模型构建方法构建了一种新的再生障碍性贫血的斑马鱼模型，通过CRISPR/Cas9系统针对ddx10基因进行基因编辑，设计靶向斑马鱼ddx10基因第1号外显子的sgRNA，获得了ddx10敲除的斑马鱼突变体，该再生障碍性贫血症斑马鱼模型与人类再生障碍性贫血患者的症状十分相似，不仅可以用于研究再生障碍性贫血的发生机制，还可以用于相关治疗药物的筛选。

技术研发人员：张冲,魏雯璐,邹晓鹏,李洪强
受保护的技术使用者：湛江中心人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17