一株具有高效溶藻能力的溶藻弧菌及其对剧毒卡尔藻赤潮的应用

本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一株具有溶藻能力的溶藻弧菌及其应用。

背景技术：

1、近年来，随着全球气候变化的加剧，有害赤潮发生频率在全球范围内呈现上升趋势，有些物种还表现出全球性或者地区性地理扩散趋势。从上世纪90年代开始，我国出现的有害藻华的频率、规模以及覆盖范围呈现持续上升的趋势，同时也有新的有害藻华种类不断涌现。这种现象对我国的沿海养殖业、渔业资源、渔产品质量、生态环境以及人类健康带来了严重的危害，并威胁到沿海地区的经济可持续发展。而且，有害藻华的发生次数、规模和破坏程度都在逐步增加，形成有毒、有害藻华的种类数也在不断增长，新的有毒藻类持续出现或被发现。

2、剧毒卡尔藻(karlodiniumveneficum)是一种全球分布并产生毒素的有害藻华原因种，其有害藻华已经通过产生卡罗毒素在世界各地造成了很多鱼类的死亡。该藻种引发的赤潮在我国东南沿海不断出现，给海洋渔业带来重大的经济损失。由于剧毒卡尔藻赤潮发生频率有逐渐增加的趋势，随着全球气候变化其规模也不断扩大，开展剧毒卡尔藻赤潮防控方面的研究尤为迫切和必要。米氏凯伦藻(kareniamikimotoi)和剧毒卡尔藻都属于凯伦藻科，均为裸甲藻，也是我国近海爆发面积最大的有毒赤潮藻种，其产生的多种毒素可造成鱼类大量死亡并威胁人类正常生产生活，危害人类的健康和安全。当前防控赤潮的手段主要落在物理、化学和生物三个科学领域。物理对策虽然应用了广泛，但在实践中，其高能耗的性质以及对海洋底栖生物潜在的负面影响，增加了它的使用难度。而且，它并不能从根源上解决赤潮问题。化学方法，例如改良黏土法，虽然相对有效，但其破坏性的一面也不能忽视，它在消除赤潮的同时可能对非赤潮生物造成一定程度的损伤，对海洋生态环境的健康构成挑战。而从生物学视角，溶藻菌成为了一个新的研究焦点，因为它来自于目标水体本身，具备出色的生态安全性并能有效溶解赤潮生物，逐渐成为了赤潮防治的生物研究与产品开发的核心内容。科研界也在不断探索，寻求更好的解决方案。例如，一些科研人员在传统除藻剂和溶藻菌剂之间寻找平衡，成功研制出了创新型的溶藻制剂。他们通过筛查和隔离具有高效解藻能力的细菌，开发出经济、高效、安全的溶藻菌剂，这被视为防治赤潮与水华问题的新路向。生物方法明显满足了生态安全的要求，既高效又快速，且影响较小，因此溶藻菌这类生物技术在海洋环境保护中得到了更多的关注和重视。因此，许多学者认为，研究和开发溶藻细菌，对赤潮的预防和治理具有极其重要的意义。然而，目前尚未有针对剧毒卡尔藻的高效溶藻菌及菌剂的报道，这亟需科研力量持续投入和探索。

技术实现思路

1、本发明提供一株具有溶藻能力的溶藻弧菌及其应用，并对该菌株进行优化培养和发酵培养，将发酵产物进行菌粉研制和固定化，并用于剧毒卡尔藻和米氏凯伦藻赤潮的控制。

2、为实现上述目的采用以下技术方案：

3、一株具有溶藻能力的弧菌，为溶藻弧菌vibrio alginolyticus fdhy-f35，已于2023年12月25日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctcc m 20232678，地址为武汉，武汉大学。

4、所述的溶藻弧菌，菌种生物学特征如下：革兰氏染色呈阴性，生长的培养基呈绿色，菌落形态为圆形或椭圆形，不透明，菌落呈乳白色或淡黄色，扁平，表面光滑湿润，边缘不规则。

5、所述的具有溶藻能力的溶藻弧菌的培养方法，包括以下步骤：

6、(1)菌种：采用所述的溶藻弧菌fdhy-f35；

7、斜面培养：将步骤(1)中的菌种接种于2216e固体斜面培养基上，在25℃条件下培养24小时；

8、(3)用15ml无菌海水洗脱菌苔，菌悬液再按体积比1：20的比例接种到100ml的2216e培养液中，25℃、150r/min置于恒温振荡器中培养24h，获得初级培养菌液；

9、(4)发酵培养：将步骤(3)培养的菌液接种于液体培养基中进行培养，所述培养基和培养条件为磷酸高铁0.1g/l、海盐30g/l、0.25％蔗糖、1％蛋白胨(碳氮比1：4)、初始ph8.0、5％接种量、25℃、转速165r/min、摇瓶培养48h。

10、(5)溶藻菌的中试放大培养：在50l发酵罐中进行中试放大培养，以如权利要求2步骤(4)的培养基和培养条件进行培养，通气量0.4vvm、恒定ph8下在12h和24h进行蔗糖碳源的补料，补料量为0.25％，最终发酵时间为48小时。

11、溶藻弧菌的溶藻菌粉制备方法：

12、所得到发酵液进行喷雾干燥，条件为180℃进风温度：风机频率30hz，撞针间隔时间5.0s、撞针执行时间1.0s，蠕动速度10rpm。

13、将所得到发酵液进行喷雾干燥上清液于-80℃、真空度为13～50pa的条件下冷冻干燥48h，得到两种上清干粉。以喷雾干燥干粉处理剧毒卡尔藻，以冷冻干燥菌粉处理米氏凯伦藻。

14、溶藻菌菌粉包埋固定化方法：

15、以质量分数2％的明胶和3％的海藻酸钠混合溶解的溶液，将喷雾干燥干粉以0.012g/ml进行溶解，将溶解液滴入2％氯化钙溶液中进行交联，交联时间为20min，用于处理剧毒卡尔藻。以质量分数3％的明胶和2％的海藻酸钠混合溶解的溶液，将冷冻干燥干粉以0.015g/ml进行溶解，将溶解液滴入2％氯化钙溶液中进行交联，交联时间为20min，用于处理米氏凯伦藻。

16、将制备好的溶藻小球以海藻酸钠2％、明胶3％、氯化钙2％、交联时间30min干粉添加量0.05g/ml，2颗所制备的体积为1ml微球加入到100ml处于指数期的米氏凯伦藻藻液中进行溶藻，24小时溶藻率为100％,每24小时换新藻液，更换三次溶藻率为66％。取30只孵化出的丰年虾加入到24孔板中，各孔板的液体体积为3ml，加入体积100μl的微球进行接种，48h处理后没有明显影响。

17、以同样量的固定化小球对孵化的丰年虾卵进行接种，48h处理后没有明显影响。

18、本发明的有益效果在于：

19、1、对所筛选的溶藻弧菌fdhy-f35不同上清干粉进行固定化，通过调整包埋材料之间的配比，使得其对剧毒卡尔藻和米氏凯伦藻均具有抑制和杀灭作用。24小时溶藻率为100％,每24小时换新藻液，更换三次溶藻率为66％。

20、2、通过适当提高包埋物的含量，对于米氏凯伦藻其连续溶藻性能在所述的第五周期内依旧拥有20％作用的溶藻效率。

21、3、溶藻弧菌为条件致病菌，具有很强的溶藻活性，为了防止其对海洋生物造成伤害，将上清菌粉进行固定化，经环境指示动物丰年虾活性测试，该产品安全性好，对丰年虾成活率没有影响。

技术特征：

1.一株具有溶藻能力的弧菌，其特征在于，所述具有溶藻能力的弧菌为溶藻弧菌fdhy-f35 (vibrio alginolyticus fdhy-f35)，保藏编号：cctcc m 20232678。

2.如权利要求1所述的具有溶藻能力的弧菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.包含权利要求1所述溶藻弧菌的溶藻菌菌粉制备方法。

4.根据权利要求3所述的菌粉制备方法，其特征在于，利用喷雾干燥法进行制备，包括以下步骤：权利要求2步骤（5）所得到发酵液通过10000rpm离心20min后，将得到的上清液进行喷雾干燥，条件为180℃进风温度：风机频率30hz，撞针间隔时间5.0 s、撞针执行时间1.0s。

5.根据权利要求3所述的菌粉制备方法，其特征在于，利用冷冻干燥法进行制备，包括以下步骤：权利要求2步骤（5）所得到发酵液通过10000rpm离心20min后，将上清液于-80℃、真空度为13~50pa的条件下冷冻干燥48h。

6.一种包含权利要求1所述溶藻弧菌的溶藻菌菌粉包埋固定化方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以质量分数2%的明胶和3%的海藻酸钠混合溶解的溶液，将溶藻菌菌粉以0.12g/l进行溶解，将溶解液滴入2%氯化钙溶液中进行交联，交联时间为20min用于治理剧毒卡尔藻。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以质量分数3%的明胶和2%的海藻酸钠混合溶解的溶液，将溶藻菌菌粉以0.15g/l进行溶解，将溶解液滴入2%氯化钙溶液中进行交联，交联时间为30min用于治理米氏凯伦藻。

9.一种溶藻小球在溶解藻类中的应用，其特征在于，所述溶藻小球为利用权利要求6-8任一所述的方法制备得到。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将制备好的溶藻小球：海藻酸钠2%、明胶3%、氯化钙2%、交联时间30min、干粉添加量0.05g/ml，2颗所制备的体积为1ml微球加入到100ml接种到指数期的米氏凯伦藻藻液中进行溶藻，每24小时换新藻液。

技术总结
本发明提供一株具有溶藻能力的溶藻弧菌及其在控制剧毒卡尔藻赤潮中的应用，属于有害赤潮处理的微生物学领域。该溶藻菌命名为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)FDHY‑F35，保藏编号：CCTCC M 20232678。该菌种的发酵液以体积比1%加入指数生长期的剧毒卡尔藻中，6小时内的溶藻率为99.15%。以溶藻率为评价指标，最适的发酵条件为：磷酸高铁0.1 g/L、海盐30 g/L、0.25%蔗糖、1%蛋白胨、初始pH8.0、5%接种量、25℃、转速165 r/min、摇瓶培养48 h。在50 L发酵罐中试最优发酵除上述条件外还应包括：通气量0.4VVM、恒定pH8下在12 h和24 h进行蔗糖碳源的补料，补料量为0.25%。将该菌产生的溶藻物质制成溶藻菌粉进行固定化，得到的固定化小球可以连续溶藻，经环境指示种丰年虫接种试验，该溶藻小球对丰年虾成活率没有影响。

技术研发人员：石新国,周舟,陈剑锋,郭毅松
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22