用于分离鲨鱼PBMC的分离液及分离方法与流程

本发明涉及生物学免疫，具体涉及一种用于分离鲨鱼pbmc的分离液及分离方法。

背景技术：

1、pbmc（peripheral blood mononuclear cell）指外周血单个核细胞，即血液里具有单个核的细胞，包括t/b淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分。外周血中除pbmc外，还包含成熟的红细胞、多核的粒细胞（granulocytes）和无核的血小板。pbmc是免疫系统的关键组成部分，作为免疫学、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗等方向最基础的实验原料被广泛使用，因此分离外周血pbmc成为了免疫细胞研究的基础。外周血pbmc比重为1.070左右，而红细胞和多核粒细胞的比重超过1.080，因此可以采用密度梯度离心法进行pbmc的分离。

2、聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法因其价格相对低廉且操作简便，成为目前实验室中从外周血分离pbmc的主要方法。除了聚蔗糖-泛影葡胺，另外一种常用的细胞分离液介质是percoll，其主要由表面包被单层乙烯吡咯烷酮（pvp）的硅胶颗粒组成，也可被用来制备成动物外周血单个核细胞的分离液，例如专利202111035419.7公布了一种采用不同密度percoll分离溶液的梯度离心方法，对树鼩稀释抗凝全血细胞成份进行分离，并获得pbmc。

3、条纹斑竹鲨属于板鳃亚纲侧孔总目须鲨目须鲨科，是一种生活于中国南方沿海的小型底栖软骨鱼。目前国内研究利用条纹斑竹鲨开发纳米抗体的报道越来越多，分离其pbmc用于纳米抗体文库构建的需求与日俱增。条纹斑竹鲨和其他鲨鱼、鳐鱼一样，属于软骨鱼，软骨鱼的免疫系统非常古老，一些物种甚至缺乏适应性免疫；其造血系统与人类有很大的不同，例如软骨鱼红细胞有核，但缺乏骨髓和淋巴结。因此，研究鲨鱼的造血系统将有助于我们从进化的角度更好地理解免疫学。因为不同种属的细胞离散系数及细胞带电不同，严格来讲应采用相应种属的相应密度pbmc分离液。

4、市场上现有的基于聚蔗糖-泛影葡胺分层液有多种密度可选，例如1.073，1.077，1.084g/ml，主要用于分离哺乳动物外周血pbmc分离，然而这些分层液都不适合分离鲨鱼的pbmc。如果采用上述分层液分离鲨鱼血液的pbmc，得到的pbmc层依然与红细胞层粘连而无法得到不含红细胞的pbmc。另外一种方法，也是文献中常用的方法，即直接低速离心鲨鱼血液分离pbmc，但也会遇到同样的问题，pbmc层和红细胞层粘连，而且pbmc得率很低。

5、截至本发明专利申请前，唯一一个有关鲨鱼单个核细胞分离方法的专利文献（申请号202210468678.7）报道了一种鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途，该分离液是在人源外周血单个核细胞分离液试剂基础上添加了一定浓度的无机盐、尿素、水等，将分离液密度从1.077g/ml降为1.049~1.058g/ml之间，分离步骤中所用的离心力为1000g，从而将鲨鱼的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开。然而，这种方法需要稀释血液的比例较大(2-3倍)，分离液试剂与鲨鱼稀释液的比例较高(约6:4~7:3之间)，因此消耗的试剂成本和时间成本较高，且离心力较大，有可能对细胞活力造成一定影响。

技术实现思路

1、有鉴于此，提供一种易于保存、操作简便、分离纯度高的用于分离鲨鱼pbmc的分离液及分离方法，有效地解决了现有常用聚蔗糖-泛影葡胺分层液无法将鲨鱼的pbmc和红细胞分开的问题，分离得到的pbmc纯度高，数量多，为鲨鱼纳米抗体和免疫学研究对高纯度pbmc的需求提供了有效的解决方案。

2、一种用于分离鲨鱼pbmc的分离液，所述分离液是在100ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液中含有1~2 g nacl，所述分离液的密度为1.087g/ml-1.097 g/ml。

3、优选地，所述分层液的密度为1.077g/ml。

4、优选地，所述分离液是在100ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液中含有1.25~1.75 gnacl，所述分离液的密度为1.090g/ml-1.095g/ml。通过添加nacl能精准地改变液体的密度、渗透压等。

5、以及，一种用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其包括以下步骤：

6、a.将鲨鱼新鲜抗凝全血与鲨鱼血稀释液混合后，与如上所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离液按照预定体积比配伍加入离心管中，先加入分离液，再加入稀释的鲨鱼血，使两种液体固定分隔为上下两层而互不混合，上层为稀释的鲨鱼血，下层为分离液，保持两种液体之间的清晰界面；

7、b.将具有上下两层液体的离心管在400-600g离心力下离心预定时间；

8、c.丢弃上清液，向离心管中加入鲨鱼血稀释液，混合均匀后，离心预定时间；

9、d.丢弃上清液，重悬管底的细胞团块于鲨鱼血稀释液中，离心预定时间，重复本步骤两次以上。

10、优选地，在各步骤中的所述鲨鱼血稀释液组分为1l水中含有nacl 19.86 g，kcl0.2 g，na2hpo41.44 g，kh2po40.24 g，urea 27.68 g，所述鲨鱼血稀释液的ph为7.4。

11、优选地，在步骤b离心后，分离管中从上到下会出现四个分层，第一层为血浆层，第二层为乳白色的pbmc层，第三层为透明的分离液层，第四层为红细胞层，用一次性塑料巴氏管沿管壁周缘吸取乳白色的pbmc层置15ml离心管中，每次离心时关闭离心机的制动器，以避免减速过程中破坏密度梯度。

12、优选地，在步骤b中，离心管是在500g离心力下离心，离心时间大约为30分钟。

13、优选地，在步骤c和步骤d中，离心管是300g离心力下离心，离心时间大约为10分钟。

14、优选地，在步骤a中，所述鲨鱼新鲜抗凝全血与鲨鱼血稀释液是等体积混合，混合液再与所述分离液以1：1体积比配伍加入离心管中。

15、优选地，在完成步骤d后，进一步将离心后的上清液丢弃，将细胞重悬于0.1~0.2ml鲨鱼血稀释液以备用或根据下一步实验要求处理。

16、上述用于分离鲨鱼pbmc的分离液及分离方法中，发明人经过试验摸索出100ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液含有氯化钠1~2 g ，更优为1.25~1.75g，使得所述分离液的密度为1.090g/ml-1.095 g/ml，形成适宜密度的分离液配方。其中，添加有nacl的聚蔗糖-泛影葡胺分层液在离心管内形成一密度介质，将鲨鱼血细胞混悬液置于介质的顶部，因不同细胞之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，不同细胞各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而使不同细胞分层、分离即可获得高纯度的鲨鱼pbmc。该分离液组分简单，分离操作简便易行，且各组分都是非常稳定的物质，制备的分离液易保存，简化了制备工艺和储存条件。

技术特征：

1. 一种用于分离鲨鱼pbmc的分离液，其特征在于，所述分离液是在100ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液中含有1~2 g nacl，所述分离液的密度为1.087g/ml-1.097 g/ml。

2.如权利要求1所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离液，其特征在于，所述分层液的密度为1.077g/ml。

3. 如权利要求1所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离液，其特征在于，所述分离液是在100ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液中含有1.25~1.75 g nacl，所述分离液的密度为1.090g/ml-1.095g/ml。

4.一种用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

5. 如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在各步骤中的所述鲨鱼血稀释液组分为1l水中含有nacl 19.86 g，kcl 0.2 g，na2hpo4 1.44 g，kh2po40.24 g，urea 27.68 g，所述鲨鱼血稀释液的ph为7.4。

6.如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在步骤b离心后，分离管中从上到下会出现四个分层，第一层为血浆层，第二层为乳白色的pbmc层，第三层为透明的分离液层，第四层为红细胞层，用一次性塑料巴氏管沿管壁周缘吸取乳白色的pbmc层置15ml离心管中，每次离心时关闭离心机的制动器，以避免减速过程中破坏密度梯度。

7.如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在步骤b中，离心管是在500g离心力下离心。

8.如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在步骤c和步骤d中，离心管是300g离心力下离心。

9.如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在步骤a中，所述鲨鱼新鲜抗凝全血与鲨鱼血稀释液是等体积混合，混合液再与所述分离液以1：1体积比配伍加入离心管中。

10.如权利要求4所述的用于分离鲨鱼pbmc的分离方法，其特征在于，在完成步骤d后，进一步将离心后的上清液丢弃，将细胞重悬于0.1~0.2ml鲨鱼血稀释液以备用或根据下一步实验要求处理。

技术总结
本发明涉及一种用于分离鲨鱼PBMC的分离液，是在100mL聚蔗糖‑泛影葡胺分层液中含有1~2 g NaCl，所述分离液的密度为1.087g/mL‑1.097 g/mL。分离方法为将鲨鱼新鲜抗凝全血与鲨鱼血稀释液混合后，再与分离液配伍，离心后得到分层明显的PBMC层，再经过多次细胞重悬和离心分离，得到高纯度的鲨鱼PBMC。该分离液组分简单，分离操作简便易行，且各组分都是非常稳定的物质，制备的分离液易保存，简化了制备工艺和储存条件。

技术研发人员：危立坤,卢烁
受保护的技术使用者：深圳市捷博生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17