基于CRISPR/Cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法及应用与流程

本发明涉及生物，涉及采用基因编辑技术进行黑水虻预蛹和蛹颜色的改造，具体涉及一种基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，还涉及相应的黑水虻crispr/cas9基因编辑试剂盒及改造组合物。

背景技术：

1、黑水虻(hermetia illucens)又称亮斑扁角水虻，属于昆虫纲双翅目、水虻科stratiomyidae，其幼虫以自然界腐烂的有机物和动物粪便等为食，是一种重要的资源昆虫。近年来，基于水虻进行资源转化的模式在国内外被快速推广和应用。利用水虻幼虫高效处理秸秆、餐余垃圾和动物粪便，既可解决目前主要采用填埋和焚烧处理带来的二次污染和资源浪费等问题，虫粪也可作为有机肥料。

2、更为重要的是，黑水虻幼虫在转化有机废弃物的过程中能够积累大量的蛋白质和脂肪，预蛹和蛹均富含动物生长发育所需各种氨基酸、钙、壳聚糖微量元素等营养物质，可作为家畜或水产养殖动物蛋白饲料的优质蛋白质饲料来源，用来部分替代鱼粉、豆粕等传统动植物蛋白，解决我国蛋白资源短缺的问题。据英国《卫报》报道，目前，刚果民主共和国正在推行一个5万英镑的援助项目，计划将黑水虻列入人们的菜单。根据该援助项目的倡议，将在刚果北基伍和南基伍省“促进昆虫的生产，用于人类的食物或制造动物的饲料”。同样在津巴布韦，也在鼓励人们食用资源昆虫。

3、食品讲究色、香、味俱全，其中颜色起到重要作用。恰到好处的食品颜色，能通过视觉感官刺激增强食欲。为了增强人和动物的食欲，食品中经常添加各种颜色来吸引消费者。研究表明，黄色常与快乐联系在一起，是一种容易让人感觉到温馨的颜色，也是刺激食欲的颜色。然而，目前饲养应用的黑水虻预蛹和蛹是棕黑色的，影响人和动物的感官。因此亟需一种方法改变黑水虻预蛹和蛹的颜色，进而促进水虻作为食物的应用。

技术实现思路

1、本发明基于上述问题进行，目的在于提供一种改变黑水虻蛹或预蛹颜色的方法。采用crispr/cas9基因编辑方法对黑水虻儿茶酚代谢通路相关基因yellow进行敲除突变，能够获得金黄色蛹的黑水虻。该品系的黑水虻改变了预蛹和蛹的颜色，进而促进水虻作为食物的应用，从而完成了本发明。

2、为了实现上述目的，本发明具体采用的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供了一种基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，包括如下步骤：

4、a、sgrna制备

5、将黑水虻yellow基因外显子上的pam序列作为ngg的靶点，设计用于基因敲除的模板引物sgrna-f，扩增获得sgrna模板，而后以该sgrna模板大量扩增获取处于单链状态的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.7所示；

6、b、黑水虻胚胎显微注射及培养

7、将步骤a得到的sgrna和cas9蛋白混合后显微注射到刚产的黑水虻受精卵中，并置于培养箱中培养，得到表面为金黄色的黑水虻预蛹和蛹。

8、优选的：步骤(a)中，靶点的核苷酸序列如seq id no.4所示；模板引物sgrna-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.6所示。

9、扩增获得sgrna模板时的反应体系如下：10×kod fx缓冲液25μl，2mm dntps 10μl，正反向引物各2.5μl，kod fx聚合酶1μl，灭菌双蒸水加至50μl；pcr反应条件如下：94℃2min；98℃10s，68℃10s，30个循环；68℃5min。

10、优选的：步骤(b)中，sgrna和cas9蛋白的终浓度均控制在300ng/μl；所述的cas9蛋白是常规的，较佳的购自thermo fisher公司。

11、黑水虻受精卵的培养条件如下：温度25℃，相对湿度60％，光暗周期l:d为16h:8h。培养过程中挑选出表面为金黄色的黑水虻预蛹和蛹幼体。

12、培养完毕后，对突变个体进行检测的引物的核苷酸序列分别如seq id no.8和9所示。先提取黑水虻总rna并反转录为cdna，采用该引物按照常规pcr条件进行扩增后，进行测序，结果显示表面为金黄色的预蛹和蛹缺失yellow基因。

13、本发明的第二方面，提供了一种黑水虻crispr/cas9基因编辑试剂盒，包括模板引物sgrna-f、反向引物以及扩增体系。其中，模板引物sgrna-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.6所示；扩增体系由10×kod fx缓冲液、2mm dntps、kod fx聚合酶以及灭菌双蒸水组成。

14、本发明的第三方面，提供了一种用于黑水虻yellow基因敲除的sgrna，其核苷酸序列如seq id no.7所示。

15、本发明的第四方面，提供了一种用于黑水虻预蛹和蛹颜色改变的组合物，包括sgrna和cas9蛋白溶液，sgrna的核苷酸序列如seq id no.7所示。sgrna和cas9蛋白溶液单独包装，使用时根据实际需求按比例混合，并在显微注射仪下通过显微注射操作注射入黑水虻受精卵内，进行基因编辑。

16、本发明的有益保障及效果如下：

17、本发明将黑水虻胚胎显微注射技术、crispr/cas9基因编辑技术及分子生物学相结合，成功实现了黑水虻yellow基因的敲除，获得黑水虻金黄色的预蛹和蛹。这种非转基因的育种养殖方式不存在任何安全隐患，为大规模推广应用黑水虻作为食用蛋白提供坚实的保障。

技术特征：

1.一种基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述靶点的核苷酸序列如seq id no.4所示，

3.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于：步骤(a)中，扩增获得sgrna模板时的反应体系如下：10×kod fx缓冲液25μl，2mm dntps 10μl，正反向引物各2.5μl，kod fx聚合酶1μl，灭菌双蒸水加至50μl；

4.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于：步骤(b)中，sgrna和cas9蛋白的终浓度均控制在300ng/μl。

5.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述黑水虻受精卵的培养条件如下：温度25℃，相对湿度60％，光暗周期l:d为16h:8h。

6.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法，其特征在于：步骤(b)中，突变检测引物的核苷酸序列分别如seq id no.8和9所示。

7.一种黑水虻crispr/cas9基因编辑试剂盒，其特征在于，包括模板引物sgrna-f以及反向引物，所述模板引物sgrna-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.6所示。

8.根据权利要求7所述的黑水虻crispr/cas9基因编辑试剂盒，其特征在于，还包括扩增体系，由10×kod fx缓冲液、2mm dntps、kod fx聚合酶以及灭菌双蒸水组成。

9.一种用于黑水虻yellow基因敲除的sgrna，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.7所示。

10.一种用于黑水虻预蛹和蛹颜色改变的组合物，其特征在于，包括sgrna和cas9蛋白溶液，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.7所示。

技术总结
本发明提供了基于CRISPR/Cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法及应用，包括如下步骤：A、sgRNA制备：将黑水虻Yellow基因外显子上的PAM序列作为NGG的靶点，设计用于基因敲除的模板引物sgRNA‑F，扩增获得sgRNA模板，而后以该sgRNA模板大量扩增获取处于单链状态的sgRNA；B、黑水虻胚胎显微注射及培养：将步骤A得到的sgRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到刚产的黑水虻受精卵中，并置于培养箱中培养，得到表面为金黄色的黑水虻预蛹和蛹。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除黑水虻Yellow基因，获得黑水虻金黄色的蛹。相较野生型棕黑色预蛹和蛹，突变体的黑水虻变为金黄色，这种金黄色的黑水虻预蛹和蛹，能够刺激动物食欲，进一步推动黑水虻预蛹和蛹作为动物蛋白源的应用。

技术研发人员：王耀辉,孔德靖
受保护的技术使用者：上海慧福德生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12