一种构建CRISPR-Cas9基因编辑载体的方法

本申请属于遗传工程，具体是一种构建crispr-cas9基因编辑载体的方法。

背景技术：

1、基因编辑是当前生命科学研究领域应用最为广泛的生物技术，自2012年crispr/cas9基因编辑技术发现以来，其以操作简易、编辑效率高的特点，广泛地被全世界各实验室用于生命科学的研究。同时，也被应用于药物开发、农业新产品研发、疾病基因治疗等领域。目前crispr基因编辑系统的载体构建，绝大多数实验室主要还是通过传统的方法来实现。参考图1，该传统方法包括载体酶切、胶回收、磷酸化、连接、转化等步骤，用于将目的基因片段插入px330、lenticrispr等基因编辑载体，该构建方法的过程复杂、繁琐、周期长，且成本较高。

技术实现思路

1、本申请所要解决的技术问题是提供一种构建crispr-cas9基因编辑载体的方法，能够快速获得目的基因的基因编辑载体，且降低成本。

2、为此，本申请采用了如下的技术方案：

3、一种构建crispr-cas9基因编辑载体的方法，包括如下步骤：

4、1)设计并合成含有目的基因靶点序列的引物；

5、2)使用上述引物，以grna空载体为模板进行pcr扩增；

6、3)将所得pcr产物用限制性内切酶dpn1消化后，进行转化，挑菌并测序鉴定。

7、在至少一个实施例中，所述引物包括正向引物和反向引物，两者的序列均包括载体序列、位于载体序列中的靶点序列，并且两者均含有一段相同的同时含有靶点序列和部分载体序列的重叠互补区。

8、在至少一个实施例中，所述目的基因为人的hsp47基因；

9、所述靶点序列为5’-caactactacgacgacgaga-3’(seq id no:1)；

10、所述引物的序列为：

11、正向引物(5’-3’)，

12、gaaacacccaactactacgacgacgagagtttaagagctatgctggaaacag(seq id no:2)；

13、反向引物(5’-3’)，

14、tcttaaactctcgtcgtcgtagtagttgggtgtttcgtcctttccacaaggt(seq id no:3)。

15、在至少一个实施例中，所述grna载体为pmd18-t-grna。

16、在至少一个实施例中，所述pmd18-t-grna载体序列为seq id no:4。

17、在至少一个实施例中，所述pcr扩增的反应体系为：

18、

19、所述pcr扩增的反应程序为：

20、

21、在至少一个实施例中，所述限制性内切酶dpn1消化的条件为37℃孵育1小时。

22、在至少一个实施例中，所述转化的过程为将消化后的pcr产物，加入能够降解甲基化质粒的感受态细胞，进行转化，过夜培养后进行挑菌。

23、在至少一个实施例中，所述挑菌的过程为挑取单个菌落，培养12小时后，再进行测序鉴定。

24、相比于传统的构建方法，本申请至少实现如下有益效果：

25、1、降低成本，无需要使用常规方法中所用的限制性内切酶、连接酶、磷酸化酶、胶回收试剂盒等，也无需大量的基本载体。

26、2、节约时间，提高效率，不需要载体的限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳和回收，无需粘性末端的磷酸化以及连接酶连接；同时，也不需要对靶序列进行变性、退火形成双链dna。

27、3、提高构建的成功率，通过pcr扩增，能够获得大量的目的载体，经过dpni消化，以及转化筛选后，能够获得高成功率的目的载体。

技术特征：

1.一种构建crispr-cas9基因编辑载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中：

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中：

技术总结
本申请涉及一种构建CRISPR‑Cas9基因编辑载体的方法。该方法包括：1)设计并合成含有目的基因靶点序列的引物；2)使用上述引物，以gRNA空载体为模板进行PCR扩增；3)将所得PCR产物用限制性内切酶Dpn1消化后，进行转化，挑菌并测序鉴定。本申请能够快速获得目的基因的基因编辑载体，且降低成本。

技术研发人员：粟小平,韦珍夏,黄旋平,李翠萍,罗秋妮,廖海清,孙俊铭,欧阳轶强
受保护的技术使用者：广西医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17