一种检测猪衣原体的引物、试剂盒和方法

本发明属于分子生物学的，具体涉及一种检测猪衣原体的引物、试剂盒和方法。

背景技术：

1、疫病防控是保障养猪产业健康发展的重中之重。而主要流行性疾病如非洲猪瘟、猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)、猪衣原体病、猪喘气病等，都给养猪业带来了巨大的经济损失。

2、猪衣原体病(swine chlamydiosis)是由猪衣原体感染引发的，尽管其发病率较低，但致死率却极高，同时该病的传播速度非常快，给猪群的健康带来严重的威胁。此外，任何年龄段、任何品种的生猪均对本病易感，尤其是妊娠母猪和仔猪更易感染。感染该病原体的患猪可经唾液、粪尿、乳汁或者其他分泌物向外界排出致病原，妊娠母猪流产后的羊水、产出的死胎或者胎衣中均会含有病原体，特别是被治愈后的患猪仍可以长期向外排毒，成为重要的传染源。然而，目前诊断该病的敏感性不高，因此常常会导致该病被误诊，延误治疗时机。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测猪衣原体的引物、试剂盒和方法，具有快捷、灵敏度高、特异性强的特点。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种检测猪衣原体的引物，所述引物包括上游引物和下游引物；

4、所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述技术方案所述的引物和荧光定量pcr扩增试剂。

7、优选的，所述荧光定量pcr扩增试剂包括dna聚合酶、dntps和mg2+。

8、本发明提供了上述技术方案所述的引物或所述检测试剂盒在制备检测猪衣原体产品中的应用。

9、本发明提供了一种检测猪衣原体的实时荧光定量pcr方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，利用上述技术方案所述的引物进行实时荧光定量pcr扩增，得到荧光定量pcr扩增曲线；

10、对所述荧光定量pcr扩增曲线进行分析并作出判断；

11、当所述荧光定量pcr扩增曲线的ct值≤35时，则判定待测样本为猪衣原体阳性；

12、当所述荧光定量pcr扩增曲线的ct值＞40或无扩增曲线时，则判定待测样本为猪衣原体阴性；

13、当所述荧光定量pcr扩增曲线的ct值＞35且ct≤40时，则将待测样本再次进行实时荧光定量pcr扩增，再次得到荧光定量pcr扩增曲线；

14、当再次得到荧光定量pcr扩增曲线ct值≤40，则待测样本为猪衣原体阳性；当再次得到荧光定量pcr扩增曲线的ct值＞40或无扩增曲线时，则判定待测样本为猪衣原体阴性。

15、优选的，所述荧光定量pcr扩增的反应体系以25μl计，包括：12.5μl的premix extaq、0.5μl的rox荧光染料、基因组dna模板2.5μl、10μm的上游引物1μl、10μm的下游引物1μl，无rna酶水补至25μl。

16、优选的，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火35s，运行40个循环。

17、优选的，所述待测样本包括组织样本。

18、有益效果：

19、本发明提供了一种检测猪衣原体的引物，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。该特异性引物是根据猪衣原体r19菌株ompa基因设计得到的，能够快速、高效、特异性的实现对猪衣原体的检测。

20、基于上述技术优势，本发明还提供了一种检测猪衣原体的实时荧光定量pcr方法。本发明通过对待测样本进行实时荧光定量pcr扩增并根据荧光定量pcr扩增曲线进行分析，能够精准的对疑似病料进行检测。实验证明，与常规pcr相比，采用本发明提供的方法检测猪衣原体，其灵敏度好，特异性强、重复性好，易于推广，具有良好的实际应用价值，为早期防制猪衣原体提供科学依据。

技术特征：

1.一种检测猪衣原体的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物；

2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物和pcr扩增试剂。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述pcr扩增试剂包括dna聚合酶、dntps和mg2+。

4.权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述检测试剂盒在制备检测猪衣原体产品中的应用。

5.一种检测猪衣原体的实时荧光定量pcr方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，利用权利要求1中所述的引物进行实时荧光定量pcr扩增，得到荧光定量pcr扩增曲线；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应体系以25μl计，包括：12.5μl的premix ex taq、0.5μl的rox荧光染料、基因组dna模板2.5μl、10μm的上游引物1μl、10μm的下游引物1μl，无rna酶水补至25μl。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火35s，运行40个循环。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括组织样本。

技术总结
本发明属于分子生物学的技术领域，具体涉及一种检测猪衣原体的引物、试剂盒和方法。本发明提供了一种检测猪衣原体的引物，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。该特异性引物是根据猪衣原体R19菌株ompA基因设计得到的，其能够快速、高效、特异性的实现对猪衣原体的检测，通过使用上述引物对待测样本进行实时荧光定量PCR扩增，能够精准的对疑似病料进行检测。实验证明，与常规PCR相比，采用本发明提供的方法检测猪衣原体，其灵敏度好，特异性强、重复性好，易于推广，具有良好的实际应用价值，为早期防制猪衣原体提供科学依据。

技术研发人员：刘国平,刘雨晴,黄江东,谭旭,周康,曾攀,杨小林,彭鼎
受保护的技术使用者：长江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24