pJEV-CMV-p54复制子质粒及其制备方法和应用

本发明涉及分子生物学，尤其涉及pjev-cmv-p54复制子质粒及制备方法和应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是一种针对家猪和野猪的严重急性、烈性、高度传染性疾病，虽然发病过程短，但死亡率高达100％。asf可通过与野猪接触、受污染的猪制品和媒介昆虫传播。该病自1921年首次报道后，主要流行于撒哈拉以南非洲地区。2007年格鲁吉亚暴发asf，随后疫情迅速蔓延至整个高加索和俄罗斯。2014年asf传入东欧大部分国家，并初步呈现出扩大流行趋势。世界动物卫生组织(world organization foranimal health,oie)将asf列为必须通报动物疫病。

2、asf的病原asfv是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链dna病毒，主要在巨噬细胞中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个orf，编码150-200种蛋白质。其中存在许多与病毒复制、免疫逃逸、病毒传播等相关的蛋白，包括p54、p72、p30等。p54蛋白由e183l编码，大小约为30ku，是病毒存活和复制的重要组成部分，与病毒的吸附有关。p54蛋白作为非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，是血清抗体的主要结合位点，有着良好的免疫原性，可作为非洲猪瘟病毒早期检测的标志物。

3、rna复制子是一种能自主复制的rna载体，保留了病毒非结构蛋白(复制/转录酶)基因，而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代，复制/转录酶可控制载体rna在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达。在黄病毒属病毒感染性克隆基础上，其复制子载体得到了成功的构建，但需要注意的是，外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础，否则会导致外源基因不表达或者传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。p54胞内区蛋白有较好的免疫原性，可以作为制备单克隆抗体的抗原。但迄今为止，能够高效表达p54蛋白的胞内区编码基因的复制子表达载体未能构建成功。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够高效表达p54胞内区域蛋白的pjev-cmv-p54复制子质粒及其制备方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了pjev-cmv-p54复制子质粒，所述复制子质粒的核酸序列如seq idno.1所示。

4、优选的，所述复制子质粒包括如seq id no.2所示的编码非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白的核酸序列。

5、本发明还提供了用于提供所述复制子质粒中的编码非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白的核酸序列的引物组，包括正向引物jd-p54-f和反向引物jd-p54-r，所述正向引物jd-p54-f的序列如seq id no.3所示，反向引物jd-p54-r的序列如seq id no.4所示。

6、本发明还提供了所述pjev-cmv-p54复制子质粒的制备方法，包括以下步骤：

7、s1.将seq id no.2所述核酸序列连接至pcaggs质粒的ecori和xhoi两个酶切位点之间，构建真核表达质粒pcaggs-p54；

8、s2.构建pjev-cmv-b602l复制子；

9、s3.以s1所述的真核表达质粒pcaggs-p54为模板，扩增出5’端含有bamhi，3’端含有xbai的目的片段，所述目的片段包含seq id no.2序列；

10、s4.用bamhi和xbai限制性内切酶分别对pjev-cmv-b602l质粒和s3所述目的片段进行双酶切后连接，得到pjev-cmv-p54复制子质粒。

11、优选的，步骤s3所述扩增目的片段的正向引物为ap-p54-f，序列如seq id no.11所述；反向引物为ap-p54-r，序列如seq id no.12所述。

12、优选的，所述pjev-cmv-b602l复制子质粒的制备方法包括以下步骤：

13、(1)设计第一引物和第三引物分别用于扩增pjev-cmv-egfp质粒序列，所述第一引物的上游添加pme i酶切位点，扩增得到片段1；所述第三引物下游添加bspe i酶切位点，扩增得到片段2；

14、(2)设计第二引物扩增asfv病毒的b602l基因，得到片段3；

15、(3)对融合片段1和融合片段2进行pcr融合，得到融合片段1+2；

16、(4)对融合片段1+2和片段3进行pcr融合，得到p2a-b602l-t2a片段；

17、(5)使用pme i限制性内切酶分别对pjev-cmv-egfp复制子质粒和p2a-b602l-t2a片段进行单酶切，回收载体1和b602l片段；

18、(6)内切酶bspe i酶切载体1得到载体2，载体2与b602l片段连接，得到pjev-cmv-b602l。

19、优选的，步骤(6)所述载体2和b602l片段的质量比为1：3～1：10。

20、本发明还提供了所述pjev-cmv-p54复制子质粒表达的p54胞内区域蛋白在制备单克隆抗体中的应用。

21、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明以缺失了c、prm和e结构蛋白基因的基因i型日本脑炎病毒基因组为骨架，在缺失结构蛋白的部位插入非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白基因，成功构建了能够高效表达非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白的pjev-cmv-p54复制子质粒，pjev-cmv-p54具有自我复制能力，并能高效表达非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白，为asfv疫苗的研发进一步提供思路。

技术特征：

1.pjev-cmv-p54复制子质粒，其特征在于，所述复制子质粒的核酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的pjev-cmv-p54复制子质粒，其特征在于，所述复制子质粒包括如seq id no.2所示的编码非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白的核酸序列。

3.用于扩增权利要求2所述复制子质粒中的编码非洲猪瘟病毒p54胞内区域蛋白的核酸序列的引物组，其特征在于，包括正向引物jd-p54-f和反向引物jd-p54-r，所述正向引物jd-p54-f的序列如seq id no.3所示，反向引物jd-p54-r的序列如seq id no.4所示。

4.权利要求1所述pjev-cmv-p54复制子质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s3所述扩增目的片段的正向引物为ap-p54-f，序列如seq id no.11所述；反向引物为ap-p54-r，序列如seq id no.12所述。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述pjev-cmv-b602l复制子质粒的制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述载体2和b602l片段的摩尔比为1：3～1：10。

8.权利要求1所述pjev-cmv-p54复制子质粒在制备单克隆抗体中的应用。

技术总结
本发明提供了pJEV‑CMV‑p54复制子质粒及制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明以缺失了C、prM和E结构蛋白基因的基因I型日本脑炎病毒基因组为骨架，在缺失结构蛋白的部位插入非洲猪瘟病毒P54胞内区域蛋白基因，成功构建了能够高效表达非洲猪瘟病毒P54胞内区域蛋白的pJEV‑CMV‑p54复制子质粒，pJEV‑CMV‑p54具有自我复制能力，并能高效表达非洲猪瘟病毒P54胞内区域蛋白，为ASFV疫苗的研发进一步提供思路。

技术研发人员：邱亚峰,魏建超,马志永,程星雨,肖长广,张妍,夏琦琦,李宗杰,李蓓蓓,刘珂,邵东华
受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5