丝瓜LaCAD基因、蛋白、重组载体、遗传转化方法及其应用

本发明属于植物组培技术和植物转基因，涉及一种丝瓜lacad基因、蛋白、重组载体、遗传转化方法及其应用。

背景技术：

1、丝瓜是一种栽培历史悠久的作物，是葫芦科丝瓜属一年生攀援植物，营养丰富且兼具医疗保健功能，生产上，丝瓜适应性、抗病性强,高产，耐高温栽培，是我国高温季节市场主要供应蔬菜之一。在丝瓜果实发育过程中伴随着明显的形态转变和复杂的生理生化变化，包括果实的伸长、增粗、纤维化以及多糖、木质素、酚类、黄酮类的合成等，这些变化均影响着果实的采后寿命和品质。

2、由于老品种的种植范围以及产量和品质一直不够理想，且长期缺乏培育的新品种，如何培育优质果实品质的丝瓜仍是目前亟待解决的问题。转基因技术因其可靶向物种基因组对其进行有效改变，可对作物进行改良，已被用于多种植物分子育种中。通过农杆菌介导的遗传转化技术将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。另外，通过农杆菌诱导产生的植物大多数都来自于单一的植物细胞，这样就能保证了其在遗传方面具有很高的稳定性，不会有嵌合体的产生。

3、木质素是一种复杂的多酚聚合物，由单木酚通过苯丙烷途径合成。木质素聚合物主要包括3种类型：对羟苯基木质素、愈创木基木质素和紫丁香基木质素。目前已知的有12种酶参与木质素合成，其中肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，cad)可以在nadph作为辅助因子存在下还原松柏醛、芥子醛、对香豆醛，产生松柏醇、芥子醇、对香豆醇等木质素单体，是参与木质素单体合成的关键酶。小麦的tacad1表现出独特的器官特异性表达模式，它在茎中表达较高，在叶中非常低。同一植物不同器官的表达变化在空间和时间上是可变的。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供一种丝瓜lacad基因、蛋白、重组载体、遗传转化方法及其应用，通过在丝瓜中过表达lacad基因来提高丝瓜中木质素的含量。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、一种丝瓜肉桂醇脱氢酶(lacad)基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供该基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、本发明还提供了含有该基因的重组载体，所述重组载体为pcambia1300-gfp-cad。

6、本发明还提供了丝瓜的遗传转化方法，所述方法具体为获得含有所述lacad基因的重组菌株，将菌株转化农杆菌液获得农杆菌侵染液；以丝瓜的无菌苗的子叶作为外植体放入农杆菌侵染液中，振荡孵育60分钟，抽真空10min，超声10min，抽真空10min，然后置于无菌的滤纸上晾干，选取生长状态稳定的外植体，继代在生根培养培养基上，pcr检测获得阳性植株。

7、本发明还提供所述基因在提高丝瓜木质素含量中的应用，所述应用为通过构建遗传转化体系，使所述lacad基因在丝瓜植株中进行过量表达。

8、本发明与现有技术相比的有益效果：

9、1、本发明利用基因工程的手段，扩增丝瓜cad基因，构建超量表达载体。

10、2、通过农杆菌介导的遗传转化获得稳定表达的转基因株系，通过导入外源基因并获得超表达cad基因丝瓜，建立了高效的筛选体系，转化效率为11.66％；在丝瓜中超表达丝瓜cad基因，使丝瓜中木质素的含量提高了4-6倍。

技术特征：

1.一种丝瓜肉桂醇脱氢酶(lacad)基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.权利要求1所述丝瓜肉桂醇脱氢酶基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.含有权利要求1所述的丝瓜肉桂醇脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pcambia1300-gfp-cad。

4.一种丝瓜的遗传转化方法，所述方法具体为获得含有权利要求1所述丝瓜肉桂醇脱氢酶基因的重组菌株，将重组菌株转化农杆菌液获得农杆菌侵染液；以丝瓜无菌苗的子叶作为外植体放入农杆菌侵染液中，振荡孵育60分钟，抽真空10min，超声10min，抽真空10min，然后置于无菌的滤纸上晾干，选取生长状态稳定的外植体，继代在生根培养培养基上，pcr检测获得阳性植株。

5.权利要求1所述丝瓜肉桂醇脱氢酶基因在提高丝瓜木质素含量中的应用，其特征在于，所述应用为通过构建遗传转化体系，使所述丝瓜肉桂醇脱氢酶基因在丝瓜植株中进行过量表达。

技术总结
本发明涉及一种丝瓜LaCAD基因、蛋白、重组载体、遗传转化方法及其应用，属于植物组培技术和植物转基因技术领域，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组载体为pCAMBIA1300‑GFP‑CAD；本发明还提供了一种丝瓜的遗传转化方法以及所述丝瓜肉桂醇脱氢酶基因在提高丝瓜木质素含量中的应用。本发明方法可以将丝瓜中木质素含量增加4‑6倍。

技术研发人员：赵竑博,王贺萍,刘建汀,汪国平,朱海生,赵敏,李静妍
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6