检测丽水穿山甲病毒的荧光定量PCR引物组及方法与流程

本发明属于生物，具体涉及检测丽水穿山甲病毒的荧光定量pcr引物组及方法。

背景技术：

1、丽水穿山甲病毒(lishui pangolin virus，lspv)是近几年来新发现的一种新型穿山甲瘟病毒。此外，我们在寄生于穿山甲体表的爪哇花蜱幼虫样本中也检测到了dypv。

2、目前对于穿山甲lspv的研究甚少，尚无相关检测方法及诊断试剂盒，因此，开发能准确、快捷、有效的鉴定lspv的技术和试剂盒对该病毒的防控是至关重要的。

技术实现思路

1、本发明的目的是为丽水穿山甲病毒检测提供一种特异、敏感、快速、简便、可定量检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组、试剂盒及方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组，包括一对特异性引物和taqman探针，所述的特异性引物为lspv-f和lspv-r，所述的lspv-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的lspv-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的taqman探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

3、优选，所述的荧光报告基团为cy5，所述的荧光淬灭基团为bhq2。

4、本发明的第二个目的是提供一种含有所述的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组的试剂盒。

5、优选，所述的试剂盒还包括2×universal probe mix、depc处理的ddh2o、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的vp11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为depc处理的ddh2o。

6、本发明的第三个目的是提供所述的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组在制备用于检测丽水穿山甲病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。

7、本发明的第四个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr方法，包括以下步骤：

8、s1. 提取待检样品的rna并反转录为cdna；

9、s2. 利用所述的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组、以步骤s1获得的cdna为模板进行荧光定量pcr扩增；

10、s3. 反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有丽水穿山甲病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线（有特异性扩增反应），则待检样品中含有丽水穿山甲病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有丽水穿山甲病毒。

11、优选，所述的步骤s2的荧光定量pcr扩增的反应体系为20 μl，包含：10 μl 2×universal probe mix、1.0 μl 10 μm的引物lspv-f、1.0 μl 10 μm的引物lspv-r、0.4 μl10 μm的taqman探针（lspv-probe）、1.0 μl cdna模板，加depc处理的ddh2o补足至20 μl；所述的荧光定量pcr扩增的反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40个循环；在60℃延伸时收集荧光信号。

12、本发明具有如下优点和有益效果：

13、本发明的一种丽水穿山甲病毒taqman荧光定量pcr检测试剂盒，其含有用于检测lspv的一对特异性引物和taqman探针。本发明的试剂盒检测结果特异性好，lspv扩增曲线良好，其他相关病原未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为1.59×101copies/μl；解决了尚无lspv检测方法的问题，对于lspv的检测具有重要意义。

技术特征：

1. 一种检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组，其特征在于，包括一对特异性引物和taqman探针，所述的特异性引物为lspv-f和lspv-r，所述的lspv-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的lspv-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的taqman探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为cy5，所述的荧光淬灭基团为bhq2。

3.一种含有权利要求1所述的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组的试剂盒。

4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括2×universalprobe mix、depc处理的ddh2o、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的vp11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为depc处理的ddh2o。

5.权利要求1所述的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr引物组在制备用于检测丽水穿山甲病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。

6.一种非疾病诊断目的的检测丽水穿山甲病毒的taqman荧光定量pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2的荧光定量pcr扩增的反应体系为20 μl，包含：10 μl 2×universal probe mix、1.0 μl 10 μm的引物lspv-f、1.0 μl10 μm的引物lspv-r、0.4 μl 10 μm的taqman探针、1.0 μl cdna模板，加depc处理的ddh2o补足至20 μl；所述的荧光定量pcr扩增的反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40个循环；在60℃延伸时收集荧光信号。

技术总结
本发明公开了检测丽水穿山甲病毒的荧光定量PCR引物组及方法。本发明的引物组包括针对丽水穿山甲病毒VP11基因的一对特异性引物和TaqMan探针，利用该引物组制备的试剂盒扩增曲线良好，具有较好的特异性和灵敏度，与除丽水穿山甲病毒之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应，最低检测浓度为1.59×10<supgt;1</supgt; copies/μL。本发明的试剂盒和检测方法具有操作方法简单、反应结果特异性强、灵敏性高、耗时短等优势。

技术研发人员：华彦,刘昊,张培霞,张治东,梁晓彤,刘莎莎,王佳怡
受保护的技术使用者：广东省林业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11