一种可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法

本发明属于水凝胶，具体涉及一种可注射型酶交联蛋清蛋白水凝胶的制备方法。

背景技术：

1、天然材料(natural materials)由于与细胞外基质(extracellular matrix，ecm)相似，且具有独特的特性，包括高生物活性、良好的细胞相容性和生物降解性，因此在生物材料领域具有巨大的潜力。目前，许多天然材料，如蛋白质(弹性蛋白、胶原蛋白、蚕丝等)和多糖(壳聚糖、透明质酸、右旋糖酐等)已被开发为多功能生物材料，包括薄膜、多孔海绵、纤维和凝胶，用于临床应用，如生物传感器、药物传递系统和组织再生支架。

2、在许多天然材料中，具有高生物活性、低免疫原性和丰富资源的蛋白质尤其受到关注。蛋清(ew)，作为天然的重要来源，已被用作烧伤敷药和伤口愈合有悠久的历史。ew是多种蛋白质的胶体混合物，其中卵清蛋白(47kda)、卵转铁蛋白(77kda)、卵球蛋白(28kda)和溶菌酶(14kda)占蛋清干物质的90％。卵清蛋白在ew中含量最多，可促进细胞粘附和增殖，而溶菌酶则具有抗菌活性。但对蛋清制备水凝胶尤其是可注射型水凝胶的应用研究鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法。

2、为实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、1)将鸡蛋蛋黄分离得到蛋清(ew)，冷冻干燥得到ew粉；

5、2)在低温反应器中，将ew粉溶于mes缓冲液中得到ew-mes溶液；

6、3)向上述溶液中加入nhs、edci和酪胺，搅拌混合得混合物，透析提纯得到ew-ta；

7、4)将ew-ta溶解在磷酸盐缓冲液中得到终浓度为10-30mg/ml的ew-ta溶液；

8、5)向步骤4)的ew-ta溶液中依次加入hrp溶液和h2o2溶液交联即得ew-ta水凝胶。本发明中，冷冻干燥优选在50-70℃下真空干燥2-5天。

9、作为本发明的进一步优选，步骤2)中，所述低温反应器的温度为0℃。

10、作为本发明的进一步优选，ew粉、酪胺的用量比为5g：1.25g。

11、作为本发明的进一步优选，mes缓冲液的浓度为10mm，ph 5.0，且ew粉与mes缓冲液的用量比为5g：150ml。

12、作为本发明的进一步优选，步骤3)中，nhs、edcl和酪胺的用量比为0.98g：1.68g：1.25g。

13、作为本发明的进一步优选，步骤3)中，搅拌时间为8h，搅拌速度为350rpm。

14、作为本发明的进一步优选，步骤3)中，透析提纯采用的超滤膜的截留分子量为3000da，透析时间为5天，透析温度25℃，透析液为去离子水。

15、作为本发明的进一步优选，步骤4)中，ew-ta溶解温度为4℃，磷酸盐缓冲液的ph＝7.4。

16、作为本发明的进一步优选，步骤5)中加入hrp溶液和h2o2溶液时，先加入hrp溶液，再加入h2o2溶液，每1ml ew溶液中加入10μlhrp溶液和10μl的h2o2溶液，其中，加入hrp溶液的浓度为1000u/ml，h2o2溶液的浓度167mm。

17、与现有技术相比，本发明的优势在于：

18、本发明通过过氧化物酶催化的交联，利用ew原位形成可注射型蛋白水凝胶，操作方便，其次，本发明通过改变ew-ta的含量，可以实现调节ew-ta水凝胶的力学性能、溶胀率和降解率。且得到ew-ta水凝胶具有良好的细胞相容性，这也进一步表明本发明制备的ew-ta水凝胶将在医用组织工程应用中具有一定的应用前景。

技术特征：

1.一种可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述低温反应器的温度为0℃。

3.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述ew粉、酪胺的用量比为5g：1.25g。

4.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，mes缓冲液的浓度为10mm，ph 5.0，且ew粉与mes缓冲液的用量比为5g：150ml。

5.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤3)中，nhs、edci和酪胺的用量比为0.98g：1.68g：1.25g。

6.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤3)中，搅拌时间为8h，搅拌速度为350rpm。

7.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤3)中，透析提纯采用的超滤膜的截留分子量为3000da，透析时间为5天，透析温度25℃，透析液为去离子水。

8.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤4)中，ew-ta溶解温度为4℃，磷酸盐缓冲液的ph＝7.4。

9.根据权利要求1所述的可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤5)中加入hrp溶液和h2o2溶液时，先加入hrp溶液，再加入h2o2溶液，每1ml ew溶液中加入10μl hrp溶液和10μl的h2o2溶液，其中，加入hrp溶液的浓度为1000u/ml，h2o2溶液的浓度167mm。

技术总结
本发明公开了一种可注射酶交联的酪胺修饰的蛋清蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1）将鸡蛋蛋黄分离得到蛋清（Eggwhite,EW），冷冻干燥得到EW粉；2）在低温反应器中，将EW粉溶于MES缓冲液中得到EW‑MES溶液；3）向上述溶液中加入NHS、EDCI和酪胺（Tyramine,TA），搅拌混合得到混合物，经透析提纯得到EW‑TA；4）将EW‑TA溶解在磷酸盐缓冲液中得终浓度为10‑30 mg/mL的EW‑TA溶液；5）向步骤4）的EW‑TA溶液中依次加入HRP溶液和H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;溶液交联即得EW‑TA水凝胶。本发明通过过氧化物酶催化的交联，利用EW原位形成可注射型蛋白水凝胶，具有良好的细胞相容性，在医用组织工程应用中具有一定的应用前景。

技术研发人员：韩艳婷,丁鹏,郭玮,聂磊,王玲
受保护的技术使用者：信阳师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8