一种嵌合抗原受体基因及其应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种嵌合抗原受体基因及其应用。

背景技术：

1、通过诱导受体免疫系统对移植物形成免疫耐受，从而减少甚至停止服用免疫抑制药物来维持移植物存活，改善器官移植的短期及长期疗效，一直是器官移植研究人员希望达到的理想目标。调节性t细胞(regulatory t cells，treg)是一类具有负调节机体免疫反应功能的t淋巴细胞，在机体内起着维持自身耐受和防止免疫反应过度损伤机体的重要作用。treg通过抑制t细胞活化及增殖、减少促炎因子释放等作用来抑制t细胞介导的炎症反应，对于治疗自身免疫性疾病，以及预防器官移植后的排斥反应都有着重要作用。最新的动物实验研究结果表明，提高treg特异识别抗原的能力，可以大大提高treg免疫疗法的有效性及特异性。如何提高treg的识别特异性抗原的能力，并增强其增殖及抑制免疫反应的能力，是treg研究的热点之一。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)技术的出现，为解决这一问题提供了重要的研究方向。

2、car技术是通过基因编辑技术，赋予t细胞能够识别特定分子标志的特异性受体，增强car-t细胞对表达该分子标志的细胞的特异性免疫，目前主要用于肿瘤的免疫治疗，在血液系统肿瘤的治疗中获得了较好的效果。car的基因结构中包括：(1)细胞外抗原结合区即单链可变区(single-chain fragment variable，scfv)片段，通常来源于经过改造后的单克隆抗体的抗原结合区，负责识别特定分子标志；(2)胞外铰链区；(3)跨膜区；(4)由t细胞受体(t-cell receptor，tcr)的胞内信号转导部分和胞内t细胞协同刺激信号共同组成的胞内信号转导区。但利用car技术改造treg，并将其用于诱导免疫耐受方面的研究甚少。

3、hla-a2是主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)最具有免疫原性的表达产物之一，也是hla-a家族中分布最广泛的基因位点，广泛表达于各种族人群之中，是t细胞识别同种异体抗原的主要细胞表面分子标志。已知人类中存在至少有31种不同的hla-a2等位基因，并且发现于50％的高加索人和35％的非裔美国人中。同种异体器官移植到受体体内后，在树突状细胞(dendritic cells，dcs)的介导下，促使受体体内的cd4+t细胞识别移植器官细胞表面的hla-a2抗原，并激活针对移植器官的排斥反应。有研究表明，能够特异识别hla-a2位点的treg与多克隆treg相比，能更有效地预防皮肤移植物发生排斥反应。程序性死亡蛋白-1(programmed death-1，pd-1)及其程序性死亡蛋白配体-1(programmed death ligand-1，pd-l1)，是细胞表面一个重要的免疫检查点，属于cd28超家族成员。该通路的激活，能够抑制效应t细胞的活化，在维持人体免疫耐受及保持人体免疫系统稳定方面起着重要的作用。然而，pd-1：pd-l1/pd-l2通路的激活在treg中却起着截然不同作用，对促进treg的分化、增殖和维持功能稳定起着重要的作用。为此，本发明尝试构建表达pd-l1并特异识别hla-a2抗原的嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞(car-treg)，探讨car-treg对促进移植物免疫耐受的作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种嵌合抗原受体基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用该嵌合抗原受体基因可以构建靶向hla-a2且表达pdl1的car-treg，能够高效的抑制cd4+t细胞增殖，这为细胞或器官移植后，诱导受体免疫系统对移植物形成免疫耐受提供了技术支持。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种嵌合抗原受体基因，所述嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

4、本发明还提供一种重组质粒，包括上述的嵌合抗原受体基因。

5、本发明还提供一种重组病毒，包括上述的重组质粒。

6、进一步地，所述重组病毒为重组慢病毒。

7、进一步地，所述重组病毒是将所述嵌合抗原受体基因插入gv401载体而构建得到。

8、本发明还提供上述的嵌合抗原受体基因、重组质粒或重组病毒在制备嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞中的应用。

9、本发明还提供一种嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞，包括上述的嵌合抗原受体基因、重组质粒或重组病毒。

10、本发明还提供一种嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞的构建方法，包括将上述的重组病毒转染至调节性t细胞中，得到所述嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞的步骤。

11、本发明还提供上述的嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞在制备诱导受体免疫耐受作用的免疫细胞治疗药物中的应用。

12、进一步地，所述免疫细胞治疗药物还包括药学上可接受的辅料。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明设计并合成了一种嵌合抗原受体基因，构建得到了靶向hla-a2且表达pdl1的car-treg，通过bamhi/ecori双酶切鉴定，应用流式细胞仪检测转染car质粒后t细胞的car表达情况；通过抑制hla-a2+/-乳腺癌细胞的增殖实验，证实car能够成功靶向hla-a2靶点；后续通过流式细胞仪检测foxp3、pdl1、cd25、icos和ctla4等与treg细胞功能相关的标志物，并联合细胞代谢分析及体外抑制cd4+t细胞增殖的实验，验证car-treg抑制cd4+t细胞的能力。结果显示，本发明构建的car-treg能够高效抑制cd4+t细胞增殖，这为细胞或器官移植后，诱导受体免疫系统对移植物形成免疫耐受提供了技术支持。

技术特征：

1.一种嵌合抗原受体基因，其特征在于，所述嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

2.一种重组质粒，其特征在于，包括权利要求1所述的嵌合抗原受体基因。

3.一种重组病毒，其特征在于，包括权利要求2所述的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒为重组慢病毒。

5.根据权利要求4所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒是将所述嵌合抗原受体基因插入gv401载体而构建得到。

6.一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体基因、权利要求2所述的重组质粒或权利要求3-5任一项所述的重组病毒在制备嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞中的应用。

7.一种嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞，其特征在于，包括权利要求1所述的嵌合抗原受体基因、权利要求2所述的重组质粒或权利要求3-5任一项所述的重组病毒。

8.一种嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞的构建方法，其特征在于，包括将权利要求3-5任一项所述的重组病毒转染至调节性t细胞中，得到所述嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞的步骤。

9.一种如权利要求7所述的嵌合抗原受体修饰的调节性t细胞在制备诱导受体免疫耐受作用的免疫细胞治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的免疫细胞治疗药物，其特征在于，所述免疫细胞治疗药物还包括药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明公开了一种嵌合抗原受体基因及其应用，涉及生物医药技术领域。该嵌合抗原受体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明根据该嵌合抗原受体基因构建得到了靶向HLA‑A2且表达PDL1的CAR‑Treg，通过抑制HLA‑A2<supgt;+/‑</supgt;乳腺癌细胞的增殖实验，证实CAR能够成功靶向HLA‑A2靶点；后续通过流式细胞仪检测与Treg细胞功能相关的标志物，并联合细胞代谢分析及体外抑制CD4<supgt;+</supgt;T细胞增殖的实验，验证CAR‑Treg抑制CD4<supgt;+</supgt;T细胞的能力，结果显示，本发明构建的CAR‑Treg能够高效抑制CD4<supgt;+</supgt;T细胞增殖，这为细胞或器官移植后，诱导受体免疫系统对移植物形成免疫耐受提供了技术支持。

技术研发人员：张剑文
受保护的技术使用者：中山大学附属第三医院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6