用于层析及比浊双平台的HbA1c单克隆抗体制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及用于层析及比浊双平台的hba1c单克隆抗体制备方法。

背景技术：

1、糖化血红蛋白是临床上常用的衡量血糖控制的重要指标,也是需要经常监测的一个血糖指标，在糖尿病诊断标准、控制目标、临床诊疗路径中均可见其身影。糖化血红蛋白有4个亚型，hba1c含量最高，占比为70-80％。测定hba1c含量的临床意义有：1.可用于评估患者2-3个月的平均血糖水平；2.可用于糖尿病的诊断；3.可用于预测糖尿病并发症的发生风险；4.用于评价治疗方案对血糖控制的有效程度。

2、目前hba1c检测方法常用的有免疫比浊法和高效液相层析法。免疫比浊法是利用糖化血红蛋白(hba1c)抗原与hba1c抗体直接测定总血红蛋白hb中的糖化血红蛋白(hba1c)的百分含量，这种免疫反应是由被测血样品种的总hb和hba1c与试剂中的hba1c抗体结合而形成凝集，凝集量随hba1c蛋白浓度的大小而变化，用生物分析仪器来进行比浊测定hba1c抗原的浓度，采用终点法，生化仪通过测定反应液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出hba1c占hb的百分含量，其准确性和重复性均有欠缺；高效液相层析法是使用离子交换高压液相色谱hplc来测定糖化血红蛋白(hba1c)的百分含量，目前被认为是分析hba1c的金标准，此方法对设备要求较高。

3、目前hba1c单克隆抗体只能应用于免疫比浊法或层析法检测hba1c含量，不利于获取准确的hba1c含量，依赖于hba1c免疫诊断试剂的检测方法正处于茁壮成长的阶段，有必要提供用于层析及比浊双平台的hba1c单克隆抗体制备方法，以提高现有hba1c含量测定的准确性和高效性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于层析及比浊双平台的hba1c单克隆抗体制备方法，解决现有hba1c单克隆抗体在hba1c含量检测中应用方式单一的问题，有利于节约成本，提高hba1c含量测定的准确性和高效性。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、用于层析及比浊双平台的hba1c单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

4、s1、抗原制备；

5、s2、动物免疫；

6、s3、细胞融合；

7、s4、克隆筛选以及杂交瘤建株；

8、s5、腹水制备以及抗体纯化；

9、s6、将步骤s5获得的hba1c抗体与菲鹏、欧凯hba1c抗体在比浊平台上对比评估，观察它们与羊抗鼠igg适配性，将步骤s5获得hb抗体进行免疫层析测试，观察hba1c抗体的灵敏度。

10、进一步地，步骤s1具体操作为：利用基因重组表达技术，得到重组hb抗原，利用化学合成的糖化多肽序列合成糖肽，将获得的糖肽进一步偶联klh以增强其免疫原性，得到合成hba1c-klh抗原。

11、进一步地，步骤s2具体操作为：采用balb/c小鼠作为免疫鼠，以重组hb和合成hba1c-klh为免疫原，进行四次免疫，使其血清效价达到融合要求。

12、进一步地，步骤s3具体操作为：对上述经过重组免疫的hba1c、hb小鼠取脾脏，利用电融合仪与sp2/0-ag14骨髓瘤细胞进行融合，铺板至96孔板。

13、进一步地，步骤s4具体操作为：

14、通过间接elisa检测细胞融合后96孔板各孔中细胞分泌抗体的情况，分别以hba1c-klh和hb作为elisa筛选包被抗原，hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)二抗作为检测抗体，筛选得到能稳定分泌人hb、hba1c特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经亚克隆化以及扩大培养，得到hba1c对应克隆的单克隆抗体和hb对应克隆的单克隆抗体。

15、进一步地，步骤s5具体操作为：将上步获得的hba1c对应克隆的单克隆抗体和hb对应克隆的单克隆抗体通过杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后经硫酸铵沉淀法和protein a亲和层析柱纯化获得，并对其抗体特性进行鉴定。

16、本发明的有益效果：

17、本发明成功制备了能稳定分泌人hbalc特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并通过其产生了hba1c对应克隆的单克隆抗体和hb对应克隆的单克隆抗体，该抗体亲和力高，特异性强，在免疫比浊平台上能够高灵敏度的结合hbalc，从而检测人血液中hbalc含量，该抗体可以作为核心试剂应用在其他免疫检测平台，满足临床上运用免疫检测方法检测hbalc的要求，此外，该项目能增加hba1c诊断试剂产品的种类及选择空间，此外，本发明设计合成hba1c半抗原，在克隆筛选时采用酶免与层析双筛选方案，可快速筛选出符合下游试剂开发的阳性克隆，提高研发效率。

技术特征：

1.用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤s1具体操作为：利用基因重组表达技术，得到重组hb抗原，利用化学合成的糖化多肽序列合成糖肽，将获得的糖肽进一步偶联klh以增强其免疫原性，得到合成hba1 c-klh抗原。

3.根据权利要求1所述的用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤s2具体操作为：采用balb/c小鼠作为免疫鼠，以重组hb和合成hba1 c-klh为免疫原，进行四次免疫，使其血清效价达到融合要求。

4.根据权利要求1所述的用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤s3具体操作为：对上述经过重组免疫的hba1 c-klh、hb小鼠取脾脏，利用电融合仪与sp2/0-ag14骨髓瘤细胞进行融合，铺板至96孔板。

5.根据权利要求1所述的用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤s4具体操作为：

6.根据权利要求1所述的用于层析及比浊双平台的hba1 c单克隆抗体制备方法，其特征在于，步骤s5具体操作为：将获得的hba1 c对应克隆的单克隆抗体和hb对应克隆的单克隆抗体通过杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后经硫酸铵沉淀法和protein a亲和层析柱纯化获得，并对其抗体特性进行鉴定。

技术总结
本发明公开了用于层析及比浊双平台的HbA1c单克隆抗体制备方法，属于生物技术领域，包括如下步骤：S1、抗原制备；S2、动物免疫；S3、细胞融合；S4、克隆筛选以及杂交瘤建株；S5、腹水制备以及抗体纯化；S6、将步骤S5获得的HbA1c抗体与菲鹏、欧凯HbA1C抗体在比浊平台上对比评估，观察它们与羊抗鼠I gG适配性，将步骤S5获得Hb、HbA1c抗体进行免疫层析测试，观察HbA1c抗体的灵敏度；本发明成功获得了Hb对应克隆的单克隆抗体和HbA1c对应克隆的单克隆抗体，HbAl c抗体在免疫比浊和免疫层析平台上能够高灵敏度的结合HbAl c,从而检测人血液中HbAl c含量。

技术研发人员：缪连军,张磊,张志鹏,郁春云
受保护的技术使用者：安徽环球基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/29