本发明涉及工业微生物,特别涉及一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。
背景技术:
1、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid,3-hb)是一种具有广泛应用潜力的重要化学品,能够参与可生物降解塑料的合成,作为生物降解塑料聚3-羟基丁酸(phb)的单体,通过微生物发酵或化学合成方法制备phb。phb具有良好的生物降解性和生物相容性,可用于包装材料、医疗器械、农业覆盖物等,还可以和其他生物聚合物共聚,以改善其物理性质,如聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-6-羟基己酸酯)等。
2、3-hb单体通过聚合形成phb后,可用于多方面应用,尤其是环保方面。随着环保要求提高,在包装领域生物可降解材料越来越受到关注,正在逐步取代传统不可降解塑料。聚羟基丁酸酯的物理性能,机械性能与聚丙烯类似,并且具有可生物降解性,在自然界中降解产物为二氧化碳和水,对环境无污染,故在包装领域有广泛应用前景。因此,研究开发利用高效生产3-hb的方法对于推动生物基化学品的发展,减少对有限资源的依赖以及减少环境影响具有重要意义。近年来,利用生物法合成3-hb的方法受到了广泛关注。但目前3-hb的生产面临一个主要问题:中间产物乙酸的产量较大,导致流向3-hb的量大大减少,从而降低了生产效率,成为制约3-hb生产的最大挑战。因此,亟需一种能够提高3-hb产量的方法,以提高工业生产的效率,降低生产成本。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷,本发明提出了一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。
2、本发明提供了一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法,包括如下步骤:
3、s1:体外扩增phaa、phab、tesb基因的序列,将基因的序列连接成单一片段,将单一片段导入质粒;所述tesb的核苷酸序列如seq id no.63所示。
4、s2:将s1所述质粒导入菌株中。
5、进一步的,步骤s2所述菌株为escherichia coli nissle 1917、escherichiacoli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseri atcc 33323和bacilluscoagulans dsm1中的任意一种。
6、本申请中使用的halomonas sp.ly03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址:广州市先列中路100号大院59号楼5楼,广东省微生物研究所,邮编510070)。保藏号为gdmcc no:63382。菌株名称为halomonas sp.ly03,分类命名为halomonas sp.。
7、进一步的,步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种;所述phaatd的核苷酸序列如seq idno.61所示,所述phaare核苷酸序列如seq id no.64所示;
8、进一步的,步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。所述phabtd的核苷酸序列如seq idno.62所示,所述phabre的核苷酸序列如seq id no.65所示;
9、进一步的,步骤s1所述单一片段为tesb-phaatd-phabtd、tesb-phaare-phabtd、tesb-phaare-phabre、tesb-phabtd-phaatd、phaatd-tesb-phabtd、phabtd-tesb-phaatd、phaatd-phabtd-tesb、phabtd-phaatd-tesb中的任意一种,优选为phaatd-tesb-phabtd。
10、所述tesb-phaatd-phabtd的核苷酸序列如seq id no.53所示;所述tesb-phaare-phabtd的核苷酸序列如seq id no.54所示;所述tesb-phaare-phabre的核苷酸序列如seq idno.55所示;所述tesb-phabtd-phaatd的核苷酸序列如seq id no.56所示;所述phaatd-tesb-phabtd的核苷酸序列如seq id no.57所示;所述phabtd-tesb-phaatd的核苷酸序列如seq idno.58所示;所述phaatd-phabtd-tesb的核苷酸序列如seq id no.59所示;所述phabtd-phaatd-tesb的核苷酸序列如seq id no.60所示;
11、本发明还提供一种生产3-羟基丁酸的菌株,由所述的构建方法得到。
12、本发明还提供一种使用所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法,包括如下步骤:将菌株活化,进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
13、进一步的,所述发酵培养基中包括短链脂肪酸,优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
14、进一步的,所述短链脂肪酸的添加量为3~12g/l。
15、进一步的,所述发酵的温度为36~42℃,ph为6~11,发酵的时间为12~48h。
16、综上,与现有技术相比,本发明达到了以下技术效果:
17、(1)本发明构建的联合代谢途径菌株,提高了3-hb的产量。
18、(2)本发明对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物,减少了中间代谢产物乙酸对细菌3-hb产量的影响,进一步提高了3-hb的产量。
19、(3)本发明利用工程菌发酵生产3-hb,生产工艺简单、生产效率高,适用于工业化连续性生产。
1.一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤s2所述菌株为escherichia colinissle 1917、escherichia coli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseriatcc 33323和bacillus coagulans dsm1中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤s1所述单一片段为tesb-phaatd-phabtd、tesb-phaare-phabtd、tesb-phaare-phabre、tesb-phabtd-phaatd、phaatd-tesb-phabtd、phabtd-tesb-phaatd、phaatd-phabtd-tesb、phabtd-phaatd-tesb中的任意一种。
6.一种生产3-羟基丁酸的菌株,其特征在于,由权利要求1~5任一项所述的构建方法得到。
7.一种使用权利要求6所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:将菌株活化,进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基中包括短链脂肪酸,优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述短链脂肪酸的添加量为3~12g/l。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述发酵的温度为36~42℃,发酵的ph为6~11,发酵的时间为12~48h。