一种用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的CRISPR核酸检测试剂盒、方法和应用

本发明属于分子诊断，具体涉及一种用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr核酸检测试剂盒、方法和应用。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,s.aureus)是导致医院获得性和社区获得性感染的主要病原体。在其毒力因子库中，杀白细胞素(panton-valentineleucocidin，pvl)这种毒素与严重皮肤感染、化脓性软组织感染、坏死性筋膜炎和坏死性肺炎等严重疾病密切相关。感染pvl阳性金黄色葡萄球菌的患者通常表现出更严重的症状，并面临更严重的预后,感染的死亡风险要高得多。目前，金葡菌毒力因子的检测主要是通过检测已知毒力基因和测定毒素活性两方面来进行，主要方法有：(1)免疫学方法：利用抗原抗体反应来检测毒力因子，血清学检测方法如双凝胶免疫扩散法、微载玻片法、胶乳颗粒凝集法等，这些方法局限性在于只得到半定量的结果，并且结果具有主观性。(2)分子学方法：利用聚合酶链反应pcr法(金标准)鉴定其毒力基因。此种方法的局限性在于需要专业的检测人员和专用设备，且灵敏度较低。此外还有酶联免疫吸附试验(elisa)、酶联免疫荧光法等，这些方法相对简单并易于使用，特异度较高，但孵育时间长、洗涤步骤多，操作复杂且需要专业人员。因此，为了进一步推动毒力基因检测技术的前移下移，便于及时发现患者感染的金黄色葡萄球菌是否含有毒力基因pvl，以达到及时的适当治疗，亟需一种更加灵敏、简单且适用于现场的检测方法。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的问题，本发明提供一种用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr核酸检测试剂盒、方法和应用。

2、依据本发明技术方案的第一方面，提供一种用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，其包括用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr-cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

3、所述用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr-cas13a系统包括如下a1)-a3)；

4、a1)单独包装的crrna和lwcas13a蛋白，或crrna和lwcas13a蛋白复合体；

5、所述crrna的靶点序列为序列1；

6、a2)报告rna，其由20个u组成，且所述报告rna的序列两端分别标记fam和生物素；

7、a3)用于扩增待测样本靶点序列的raa扩增引物，且所述raa扩增引物中的一条引物的5'末端具有被t7 rna聚合酶识别的区域；

8、所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗fitc抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；

9、所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔igg。

10、进一步地，所述crrna的核苷酸序列为序列2。

11、更进一步地，所述raa扩增引物由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成。

12、更进一步地，所述crispr-cas13a系统还包括a4)rna聚合酶。

13、进一步地，所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：所述检测方法包括如下步骤:

14、b1、提取待测样本的核酸，所述raa扩增所需引物对待测样品核酸进行raa扩增，得到raa扩增产物；

15、b2、将所述raa扩增产物、所述crrna、所述lwcas13a蛋白在含有所述报告rna的体系中反应，得到反应产物；

16、b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；

17、若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因。

18、依据本发明技术方案的第二方面，提供用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒中的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr-cas13a系统。

19、依据本发明技术方案的第三方面，提供用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒或上面crispr-cas13a系统或所述系统中的单独包装的crrna和lwcas13a蛋白，或crrna和lwcas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用：

20、c1)检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因；

21、c2)制备检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因产品；

22、c3)检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸；

23、c4)制备检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸产品；

24、c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因；

25、c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因产品；

26、c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸；

27、c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸产品；

28、c9)筛选或辅助筛选金黄色葡萄球菌防治药物；

29、c10)制备筛选或辅助筛选金黄色葡萄球菌防治药物产品。

30、依据本发明技术方案的第四方面，提供一种检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸的方法，所述方法为非诊断目的的，包括如下步骤：

31、b1、提取待测样本的核酸，所述raa扩增所需引物对待测样品核酸进行raa扩增，得到raa扩增产物；

32、b2、将所述raa扩增产物、所述crrna、所述lwcas13a蛋白在含有所述报告rna的体系中反应，得到反应产物；

33、b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；

34、若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌pvl毒力基因。

35、与现有技术相比较，本发明一种用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr核酸检测试剂盒、方法和应用所提供蛋白和质粒具有以下有益效果：

36、本发明用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr核酸检测试剂盒及其所采用的技术基于crispr-cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于金黄色葡萄球菌pvl毒力基因检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crrna，并提供一种基于消线法的侧向流试纸，该试纸可通过crispr-cas13a系统实现对金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的现场、高灵敏、高特异地检测，灵敏度达到1copies/μl。

技术特征：

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，包括用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr-cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

2.根据权利要求1所述的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，其特征在于：所述crrna的核苷酸序列为序列2。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，其特征在于：所述raa扩增引物由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成。

4.根据权利要求1-3中任一所述的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，其特征在于：所述crispr-cas13a系统还包括a4)rna聚合酶。

5.根据权利要求1-4中任一所述的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒，其特征在于：

6.权利要求1-5中任一所述用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒中的用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的crispr-cas13a系统。

7.权利要求1-5中任一所述用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的试剂盒或权利要求6中的crispr-cas13a系统或所述系统中的单独包装的crrna和lwcas13a蛋白，或crrna和lwcas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用：

8.一种检测或辅助检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸的方法，所述方法为非诊断目的的，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种用于现场检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的CRISPR核酸检测试剂盒、方法和应用，其采用用于检测金黄色葡萄球菌pvl毒力基因的CRISPR核酸检测试纸，CRISPR核酸检测试纸是基于消线法的侧向流试纸，利用CRIPSR‑Cas13a系统对金黄色葡萄球菌pvl毒力基因进行检测；CRISPR‑Cas13a系统包括crRNA，或其与Cas13a蛋白形成的复合体；crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向金黄色葡萄球菌pvl毒力基因靶点序列的向导序列；金黄色葡萄球菌pvl毒力基因靶点序列位于金黄色葡萄球菌pvl毒力基因组第1659‑1686位；试纸包括应用于金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸的消线法试纸。本发明的CRISPR核酸检测试纸可通过CRISPR‑Cas13a系统实现对金黄色葡萄球菌pvl毒力基因核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到1copies/μL。

技术研发人员：王菁,靳力,韩尧,孙岩松,李浩
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/27