用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法与流程

本申请涉及医药，尤其涉及用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法。

背景技术：

1、细胞向细胞外环境排放多种膜(membrane)类囊泡，通常把这些囊泡叫做细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)，细胞外囊泡具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括唾液、血液、尿液和母乳等，根据不同来源、大小、生成过程，可分成外泌体(exosome)、微型囊(microvesicles)、外膜囊泡(outer membranevesicles)等，外泌体是细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的，大小约30-100nm的囊泡，微囊泡是大小约100-1000nm的囊泡。但外观上的区别不大，都具有向细胞外分泌的囊泡的共性，因此目前统称为“细胞外囊泡”。

2、目前evs的主要来源依赖于组织培养工程。一般情况下，人们多采用超速离心、免疫磁珠、差速超速离心、密度梯度离心、微滤、微流体、使用合成肽、识别膜的抗体的组合、超滤、沉淀、超声或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。

3、例如现有技术cn111670067b公开了用于从不同生物流体中分离细胞外囊泡(ev)的方法，所述基于镍的分离方法(nbi)是快速的、可扩大规模的，并且允许在生理ph纯化尺寸上异质的ev，保持它们在溶液中的完整性和稳定性。

4、现有技术cn112717844b公开了用于胞外囊泡富集的磁性纳米材料，包括将具有高亲和性捕获胞外囊泡的分子以及金属离子修饰到磁性纳米材料表面而获得的功能化材料。

5、现有技术cn113631240b公开了一种从生物样品中提取微泡的方法，所述方法包括以下步骤：将多价阳离子材料加入所述生物样品以形成聚集体，其中所述微泡和所述多价阳离子材料通过电荷力聚集；当包括所述聚集体的所述生物样品通过捕获滤器时通过所述捕获滤器捕获所述聚集体。

6、现有技术cn116904397a公开了运用密度梯度离心法，分离脐带血单个核细胞制备浓缩的细胞外囊泡。

7、现有技术cn116694562b公开了脑微血管内皮细胞受到下调mir-31-5p表达的干预后释放的小细胞外囊泡。

8、现有技术cn115778890b公开了通过差速离心制得洋甘菊胞外囊泡。

9、现有技术cn114752561b公开了使用一种基于聚多巴胺纳米粒子的细胞外囊泡分离方法。

10、现有技术cn114672456a公开了利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法及应用。

11、cn 115786254 b公开了在外泌体提取过程中使用刺激培养，所述刺激培养为在细胞培养过程中进行重复磁刺激。

12、使用超高速离心分离获得的细胞外囊泡纯度较高，但是分离所需设备条件较高，分离过程繁琐。商业化分离试剂盒操作简便，且细胞外囊泡分离效率高，但是细胞外囊泡纯度很低，掺杂很多杂质。其他分离方法如色谱法、微流控法等都很难实现细胞外囊泡的规模化分离。

13、总之，目前细胞外囊泡的分离缺乏高效、简单的手段。

技术实现思路

1、本申请的一个目的是提供一种用于从生物材料中分离细胞外泡的方法，

2、至少用以解决现有技术中外囊泡的分离缺乏高效、简单的问题。

3、为实现上述目的，本申请的一些实施例提供了以下几个方面：

4、第一方面，本申请的一些实施例提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，包含(1)使用包含硫酸锌和zstk474的培养基进行培养的步骤。

5、在某些实施例中，所述硫酸锌的浓度为0.1mg/l，zstk474的浓度为0.5μm。

6、在某些实施例中，还包含(2)在培养过程中使用细胞刺激的步骤。

7、在某些实施例中，所述刺激包含超声刺激和磁刺激中的一种。

8、在某些实施例中，所述刺激包含超声刺激和磁刺激。

9、第二方面，本申请的一些实施例还提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，包含以下步骤：(a)adscs细胞分离提取；(b)adscs培养，所述adscs培养使用包含硫酸锌和zstk474的培养基进行培养；(c)刺激培养；(d)外囊泡提取。

10、在某些实施例中，所述(d)外囊泡提取使用超滤法提取。

11、在某些实施例中，所述超滤法使用经过100kd的超滤管离心，2000rpm离心20min。

12、第三方面，本申请的一些实施例还提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的培养基，所述培养基的组分包含10％fbs(胎牛血清)的低糖dmem、硫酸锌和zstk474。

13、第四方面，本申请的一些实施例还提供了一种外囊泡，所述外囊泡由上述方法分离获得。

14、相较于现有技术，本申请实施例提供的方案中，至少具有如下有益效果：本发明优化了培养基和培养条件，经本申请的方法获得外囊泡数量和囊泡所含蛋白量得到显著提高。由于培养基构成简单，培养刺激操作简单，易进行大范围推广。

技术特征：

1.一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含(1)使用包含硫酸锌和zstk474的培养基进行培养的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述硫酸锌的浓度为0.1mg/l，zstk474的浓度为0.5μm。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，还包含(2)在培养过程中使用细胞刺激的步骤。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述刺激包含超声刺激和磁刺激中的一种。

5.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述刺激包含超声刺激和磁刺激。

6.一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，包含以下步骤：(a)adscs细胞分离提取；(b)adscs培养，所述adscs培养使用包含硫酸锌和zstk474的培养基进行培养；(c)刺激培养；(d)外囊泡提取。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述(d)外囊泡提取使用超滤法提取。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述超滤法使用经过100kd的超滤管离心，2000rpm离心20min。

9.一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包含10％fbs(胎牛血清)的低糖dmem、硫酸锌和zstk474。

10.一种外囊泡，其特征在于，所述外囊泡由权利要求1-6任一所述方法分离获得。

技术总结
本申请公开了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含(1)使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养的步骤；所述硫酸锌的浓度为0.1mg/L，ZSTK474的浓度为0.5μM；进一步，所述方法还包含(2)在培养过程中使用细胞刺激的步骤。本发明优化了培养基和培养条件，经本申请的方法获得外囊泡数量和囊泡所含蛋白量得到显著提高。由于培养基构成简单，培养刺激操作简单，易进行大范围推广。

技术研发人员：武文杰,苏相相,冯蕊,姜爱娜
受保护的技术使用者：中源协和生物细胞存储服务（天津）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10