一种植物乳杆菌的联合发酵方法、发酵产物及其应用与流程

本发明涉及生物和发酵工程，特别涉及一种植物乳杆菌的联合发酵方法、发酵产物及其应用。

背景技术：

1、随着人们对食品健康要求的提高，益生菌作为一种对机体有益的微生物，在提高免疫力、预防肠道疾病等方面发挥重要作用。

2、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)是一种常见的益生菌，具有耐酸、耐胆盐、适应肠道环境等特点。然而，单一的益生菌发酵往往存在菌种互作、协同作用等方面的局限性，因此，如何提高益生菌的发酵效果及其应用范围是当前研究的重点。

3、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)是仅次于大肠埃希菌的泌尿系统感染的主要病原菌，肾结石和膀胱结石的形成可能与变形杆菌感染有关，有的菌株可引起败血症、食物中毒、腹膜炎、脑膜炎等。

4、奇异变形杆菌噬菌体是一种可以裂解该菌种的病毒，具有高效专一性。然而，目前尚未有报道将奇异变形杆菌噬菌体应用于益生菌发酵领域，以实现更高效的益生菌发酵及其应用。

5、因此，基于现有技术存在的问题，本发明首创将奇异变形杆菌噬菌体应用于益生菌发酵领域，以实现更高效的益生菌发酵效率与发酵液应用的探究。

技术实现思路

1、本发明旨在解决上述现有技术存在的问题，提供了一种植物乳杆菌的联合发酵方法、发酵产物及其应用，本发明首创将奇异变形杆菌噬菌体应用于益生菌发酵领域，以实现更高效的益生菌发酵效率与发酵液应用的探究。

2、具体的，本发明提供的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一株植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）lp-22001，保藏编号为：cgmcc no：29173。所述植物乳杆菌lp-22001分离自动物粪便，菌株为革兰氏阳性、触酶阴性，分子生物学鉴定为植物乳杆菌；于2023年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no：29173，目前状态为存活。

4、具体的，所述植物乳杆菌lp-22001乳酸产生实验显示其在发酵16后的发酵液ph值约为4.21-4.45；耐酸实验显示其在强酸环境中，处理3小时活菌数仅下降约0.1-0.31gcfu/ml，具有很好的耐酸能力；抑菌谱显示植物乳杆菌lp-22001发酵液对奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维式弧菌、爱德华菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鸭疫里默氏杆菌等均具有明显的抑制作用。

5、第二方面，本发明提供一株奇异变形杆菌噬菌体rkp-p-23001，保藏编号为：cgmccno：45784。

6、具体的，所述奇异变形杆菌噬菌体rkp-p-23001由奇异变形杆菌p-23001与山东发病的养殖场采取粪便污水样筛选获得。所述噬菌体rkp-p-23001有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约40.199nm，有一个长约399.079nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为长尾噬菌体科。

7、进一步的，奇异变形杆菌噬菌体（proteus mirabilis bacteriophage）rkp-p-23001与奇异变形杆菌p-23001配套保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年11月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no：45784，目前状态为存活。

8、第三方面，本发明提供一种植物乳杆菌的联合发酵方法，包括如下步骤：

9、s1：将植物乳杆菌在mrs液体培养基中37℃培养16小时，备用；

10、s2：将奇异变形杆菌噬菌体100μl(效价1×108pfu/ml)与100μl奇异变形杆菌菌液(od1.0)混合加入到lb液体培养基中，摇床过夜培养，离心过滤，备用；

11、s3：将植物乳杆菌按照2％-5％的接种量、奇异变形杆菌1％-3％的接种量和奇异变形杆菌噬菌体1％-3％的接种量，放入装有mrs培养基的发酵设备中进行联合发酵，发酵时间为16h，发酵温度为36～38℃，溶氧量为20％。

12、进一步的，所述植物乳杆菌为lp-22001，保藏编号为：cgmcc no：29173。

13、进一步的，所述奇异变形杆菌噬菌体为rkp-p-23001，保藏编号为：cgmcc no：45784。

14、进一步的，所述mrs液体培养基的配方为：蛋白胨：10.0～12.0g/l、牛肉粉：8.0～9.0g/l、酵母粉：4.0～5.0g/l、葡萄糖：20.0～25.0g/l、磷酸氢二钾：2.0～2.5g/l、柠檬酸氢二铵：2.0～2.5g/l、乙酸钠：5.0～5.6g/l、硫酸镁：0.2～0.25g/l、硫酸锰：0.04～0.05g/l、吐温80：1.0g/l，ph值5.7±0.2，25℃。

15、第四方面，本申请还提供了一种植物乳杆菌联合发酵产物，由第三方面所述的任一方法制备所得。

16、可选的，所述发酵产物有两种形式，一种形式将同时含有植物乳杆菌、奇异变形杆菌、奇异变形杆菌噬菌体的无菌发酵液低温保存(发酵液含菌株和噬菌体)；

17、另一种形式进行10，000-12，000rpm离心10min，得到含有植物乳杆菌发酵产物和噬菌体混合的发酵产物(发酵液不含菌株和噬菌体)。

18、第五方面，本发明还提供了第四方面所述的发酵产物在兽用防治肠道感染奇异变形杆菌中的应用。

19、第六方面，本发明还提供了第四方面所述的发酵产物在益生菌和/或益生元联合噬菌体生物制剂中的应用。

20、第七方面，本发明还提供了第四方面所述的发酵产物在环境消杀中的应用。

21、本发明具有如下有益效果：

22、1、本发明分离获得植物乳杆菌lp-22001，保藏编号为：cgmcc no：29173。

23、2、本发明分离获得奇异变形杆菌p-23001与奇异变形杆菌噬菌体为rkp-p-23001，保藏编号为：cgmcc no：45784。

24、3、本发明首创的植物乳杆菌与奇异变形杆菌噬菌体联合发酵方法，通过引入噬菌体，提高了益生菌的发酵效果和稳定性。实验结果表明由植物乳杆菌菌落计数结果显示，联合发酵为单独发酵的菌落数的47.5倍；由噬菌体效价结果显示，噬菌体联合发酵是噬菌体单独发酵的6.25倍。

25、4、本发明通过优化发酵条件和方法，得到了具有更高活菌数和更稳定益生性质的益生菌发酵产物，对动物疾病的防治、动物倡导平衡的调节具有很好的作用。

26、5、本发明的联合发酵方法操作简单，可用于工业化生产。此外，该联合发酵方法还可应用于其他益生菌和噬菌体的联合发酵中，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一株植物乳杆菌lp-22001，其特征在于，保藏编号为：cgmcc no：29173。

2.一株奇异变形杆菌噬菌体rkp-p-23001，其特征在于，保藏编号为：cgmcc no：45784。

3.一种植物乳杆菌的联合发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种植物乳杆菌的联合发酵方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为lp-22001，保藏编号为：cgmcc no：29173。

5.根据权利要求3所述的一种植物乳杆菌的联合发酵方法，其特征在于，所述奇异变形杆菌噬菌体为rkp-p-23001，保藏编号为：cgmcc no：45784。

6.根据权利要求3所述的一种植物乳杆菌的联合发酵方法，其特征在于，所述mrs液体培养基的配方为：蛋白胨：10.0～12.0g/l、牛肉粉：8.0～9.0g/l、酵母粉：4.0～5.0g/l、葡萄糖：20.0～25.0g/l、磷酸氢二钾：2.0～2.5g/l、柠檬酸氢二铵：2.0～2.5g/l、乙酸钠：5.0～5.6g/l、硫酸镁：0.2～0.25g/l、硫酸锰：0.04～0.05g/l、吐温80：1.0g/l，ph值5.7±0.2，25℃。

7.一种植物乳杆菌联合发酵产物，其特征在于，由权利要求3至6任一方法制备所得。

8.如权利要求7所述的发酵产物在兽用防治肠道感染奇异变形杆菌中的应用。

9.如权利要求7所述的发酵产物在益生菌和/或益生元联合噬菌体生物制剂中的应用。

10.如权利要求7所述的发酵产物在环境消杀中的应用。

技术总结
本发明公开了一种植物乳杆菌的联合发酵方法、发酵产物及其应用。其中联合发酵方法包括如下步骤：S1：将植物乳杆菌在MRS液体培养基中37℃培养16小时，备用；S2：将奇异变形杆菌噬菌体与奇异变形杆菌混合加入到LB液体培养基中，摇床过夜培养，离心过滤，备用；S3：将植物乳杆菌按照2％‑5％的接种量、奇异变形杆菌1％‑3％的接种量和奇异变形杆菌噬菌体1％‑3％的接种量，放入装有MRS培养基的发酵设备中进行联合发酵，发酵时间为16h，发酵温度为36～38℃。上述方法所得发酵产物在兽用防治肠道感染奇异变形杆菌中的应用、在益生菌和/或益生元联合噬菌体生物制剂中的应用、在环境消杀中的应用。本发明首创在益生菌发酵中引入噬菌体，提高了益生菌的发酵效果和稳定性。

技术研发人员：杜新永,刘长太,崔翠,腾雨晴,刘雨
受保护的技术使用者：瑞科盟（青岛）生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5