乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法与流程

本发明涉及生物医学领域技术，尤其是指一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法。

背景技术：

1、类器官(organoid) 是来源于干细胞或器官祖细胞的三维细胞聚集体, 可分化和自组织形成具有人体相应器官的部分特定功能和结构。由于类器官具有人源性，可模拟器官发育和形成，在体外长期扩增中具有基因组稳定性，并能够形成活体生物库进行高通量筛选等优势，成为近年来备受关注的体外模型。个性化癌症疗法对每位患者采用特定的治疗方法。使用与原始肿瘤特征相似的个性化肿瘤模型，可以更准确地预测患者对药物的反应。与传统的模型相比，肿瘤类器官模型有几个优点，包括保留了原始肿瘤的分子和细胞组成。这些优势凸显了肿瘤类器官在个性化癌症治疗中的巨大潜力，特别是在临床前药物筛选和预测患者对选定治疗方案的反应方面。

2、乳腺癌是全球女性最常见的癌症，乳腺癌在女性患者中己超过肺癌成为发病率最高的恶性肿瘤。因此，构建出高质量的人乳腺癌类器官能够为乳腺癌患者药物反应预测和治疗选择提供有力的技术支持。目前，针对组织量比较大的手术样本的乳腺癌类器官的构建技术已相对成熟，然而乳腺癌穿刺样本及一些小组织样本组织较小，解离出较多数量的单细胞相对困难。申请号为201911281650.7、授权公告号为cn 111349603b的中国发明公开了一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，现有技术中的酶解方式多为总胶原酶解离，该方法对细胞的损伤大，易产生大量的死细胞，且酶解时间控制不当容易导致细胞活力下降，影响类器官构建成功率，此外，现有技术中利用乳腺癌类器官完全培养基作为组织解离液成本较高，不能较好地维持细胞活力，使细胞在消化过程中充分释放，不利于产业化；因此，针对乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法仍亟需优化。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其显著提升了乳腺癌临床穿刺样本的细胞得率，并提高了乳腺癌穿刺样本的类器官构建成功率；本申请还公开了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液，该组织解离液能较好地维持细胞活力，使细胞在消化过程中充分释放，提高活细胞得率，并能显著降低成本。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，包括如下步骤：

4、s1、样本处理：样本离体后马上放入组织保存液中，于冰上转运至实验室中，用预冷的dmem/f-12培养基对组织进行洗涤后，将肿瘤组织块剪切成大块，再切成小块，去除明显的有脂肪组织以及坏死肿瘤组织；

5、s2、酶解：将剪碎的肿瘤组织转移到组织解离液中，消化处理，使组织充分解离，释放肿瘤细胞；

6、s3、红细胞裂解：酶解完成后加入dmem/f-12进行离心，去上清得到细胞沉淀，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，室温放置5min，进行红细胞裂解，然后加入酶解终止剂终止；

7、s4、过筛：将裂解后的细胞悬液进行细胞筛过滤、充分洗涤细胞筛网，收集滤液离心，去上清，得到高纯度的原代肿瘤细胞；

8、s5、铺板培养：用matrigel将细胞沉淀进行重悬，铺至未处理孔板中，待基质胶凝固后加入乳腺癌类器官完全培养基，于培养箱中进行培养。

9、 作为一种优选方案：所述步骤s2中的组织解离液包括终浓度为1x的advanceddmem/f12、终浓度为1%的penicillin-streptomycin、终浓度为1.5mg/ml的胶原酶ⅲ、终浓度为10mm的hepes、终浓度为1x的glutamax、终浓度为10μm的y-27632和终浓度为2%的fbs。

10、作为一种优选方案：所述步骤s5中乳腺癌类器官完全培养基包括终浓度为10%的r-spondin3、终浓度为10%的noggin、终浓度为1x的b27含va、终浓度为10mm的nicotinamide、终浓度为1.25mm的n-acetylcysteine、终浓度为100ug/ml的primocin、终浓度为5um的y-27632、终浓度为5nm的neuregulin1、终浓度为5ng/ml的fgf-7、终浓度为20ng/ml的fgf-10、终浓度为0.5um的a83-01、终浓度为5ng/ml的egf、终浓度为1um的sb202190和终浓度为100μm的β-estradiol。

11、作为一种优选方案：所述步骤s4中充分洗涤细胞筛网所用的洗涤液包括终浓度为1x的advanced dmem/f12、终浓度为1%的penicillin-streptomycin、终浓度为10mm的hepes、终浓度为1x的glutamax和终浓度为2%的fbs。

12、作为一种优选方案：所述步骤s1中的组织保存液包括advanced dmem/f12、2%的fbs、10μm的y-27632。

13、作为一种优选方案：所述步骤s1中dmem/f-12培养基包括dmem培养基和ham's f–12培养基，其中dmem培养基和ham's f–12培养基的体积比为1:1；dmem/f-12培养基中含有酚红、l-谷氨酰胺和hepes。

14、作为一种优选方案：所述步骤s2中酶解的时间为0.5-3小时；消化处理具体条件为：于37℃恒温摇床上，100-120rpm/min消化0.5-1小时，每隔15 min用手摇一次。

15、作为一种优选方案：所述步骤s3中红细胞裂解液为1-2ml；酶解终止剂为含有5%fbs的f12培养基。

16、作为一种优选方案：所述步骤s4中洗涤细胞筛网所用的润洗液为含5%fbs的f12；离心的条件为：离心转速为1000rpm,离心温度为4℃，离心时间为5分钟。

17、作为一种优选方案：所述步骤s5中于培养箱中进行培养的条件：温度为37℃，培养箱为浓度是5％的co2培养箱。

18、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，本申请提供的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法显著提升了乳腺癌临床穿刺样本的细胞得率，并大大提高了乳腺癌穿刺样本的类器官构建成功率；本申请还公开了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液，该组织解离液能较好地维持细胞活力，使细胞在消化过程中充分释放，提高活细胞得率，并能显著降低成本；本申请实施例的乳腺癌穿刺样本组织解离液能够适用于人源乳腺癌类器官的提取，尤其适用于乳腺癌的个性化样本，能够维持每一例病人原发组织的形体结构和病理特征。

19、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

技术特征：

1.一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s2中的组织解离液包括终浓度为1x的advanced dmem/f12、终浓度为1%的penicillin-streptomycin、终浓度为1.5mg/ml的胶原酶ⅲ、终浓度为10mm的hepes、终浓度为1x的glutamax、终浓度为10μm的y-27632和终浓度为2%的fbs。

3.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s5中乳腺癌类器官完全培养基包括终浓度为10%的r-spondin3、终浓度为10%的noggin、终浓度为1x的b27含va、终浓度为10mm的nicotinamide、终浓度为1.25mm的n-acetylcysteine、终浓度为100ug/ml的primocin、终浓度为5um的y-27632、终浓度为5nm的neuregulin1、终浓度为5ng/ml的fgf-7、终浓度为20ng/ml的fgf-10、终浓度为0.5um的a83-01、终浓度为5ng/ml的egf、终浓度为1um的sb202190和终浓度为100μm的β-estradiol。

4.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s4中充分洗涤细胞筛网所用的洗涤液包括终浓度为1x的advanced dmem/f12、终浓度为1%的penicillin-streptomycin、终浓度为10mm的hepes、终浓度为1x的glutamax和终浓度为2%的fbs。

5.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s1中的组织保存液包括advanced dmem/f12、2%的fbs、10μm的y-27632。

6.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s1中dmem/f-12培养基包括dmem培养基和ham's f–12培养基，其中dmem培养基和ham's f–12培养基的体积比为1:1；dmem/f-12培养基中含有酚红、l-谷氨酰胺和hepes。

7.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s2中酶解的时间为0.5-3小时；消化处理具体条件为：于37℃恒温摇床上，100-120rpm/min消化0.5-1小时，每隔15 min用手摇一次。

8.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s3中红细胞裂解液为1-2ml；酶解终止剂为含有5%fbs的f12培养基。

9.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s4中洗涤细胞筛网所用的润洗液为含5%fbs的f12；离心的条件为：离心转速为1000rpm,离心温度为4℃，离心时间为5分钟。

10.根据权利要求1所述的乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其特征在于：所述步骤s5中于培养箱中进行培养的条件：温度为37℃，培养箱为浓度是5％的co2培养箱。

技术总结
本发明公开一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，涉及生物医学技术领域，该种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法包括如下步骤：S1、样本处理：S2、酶解：将剪碎的肿瘤组织转移到组织解离液中，消化处理，使组织充分解离，释放肿瘤细胞；S3、红细胞裂解；S4、过筛：将裂解后的细胞悬液进行细胞筛过滤、充分洗涤细胞筛网，收集滤液离心，得到高纯度的原代肿瘤细胞；S5、铺板培养：用Matrigel将细胞沉淀进行重悬，待基质胶凝固后加入乳腺癌类器官完全培养基；本申请提供了一种乳腺癌临床穿刺样本解离得到乳腺癌类器官的方法，其显著提升了乳腺癌临床穿刺样本的细胞得率，并提高了乳腺癌穿刺样本的类器官构建成功率。

技术研发人员：张梦娜,黄珊瑜,杨智颖,蔡车国,胡隽源
受保护的技术使用者：深圳市北科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10