飞蝗Par-1基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用

本发明属于生物，涉及飞蝗的防治，特别是指飞蝗partitioningdefective 1（par-1）基因及其dsrna在飞蝗防治中的应用。

背景技术：

1、基于rna干扰技术的害虫防治具有如下优势：（1）特异性：dsrna只降解与其同源的mrna，降低了对非靶标生物的毒害效应，特别对高等动物和人类具有较高的安全性；（2）高效性：少量的dsrna就能有效地抑制靶基因的表达，且dsrna进入害虫体内可引起全身甚至子代靶基因的沉默。（3）安全性：rna在自然界极易降解，无残留，对生态环境和农作物产品无污染，相对安全。目前，基于rna干扰进行害虫防治的基础技术是筛选靶标序列获得具有高致死作用的dsrna。公开号cn112662690a的申请中公开了飞蝗rab5基因的dsrna用于防治飞蝗，飞蝗rab5基因为细胞运输的关键调节因子；公开号cn112662689a公开了一种飞蝗rab11a基因及其dsrna在飞蝗防治中的应用，飞蝗rab11a基因为飞蝗小gtp酶基因。

2、partitioning defective 1（par-1）是一种细胞极性蛋白，在细胞极性调节中发挥重要作用，是细胞极性调节的重要蛋白分子之一。细胞极性指细胞形状、结构和功能的空间不对称分布，产生的主要原因是特殊功能的蛋白质只局限于细胞膜的特殊区域。目前尚没有关于沉默飞蝗成虫par-1基因导致飞蝗致死以实现飞蝗防治的报道。

技术实现思路

1、本发明提出一种飞蝗par-1基因及其dsrna在飞蝗防治中的应用，利用飞蝗par-1基因制备的dsrna，注射至雌飞蝗体内，可使飞蝗不产卵并致死，防控飞蝗爆发成灾。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明的飞蝗par-1基因，其orf序列如seq id no.1所示，par-1基因的orf序列全长2523bp，编码840个氨基酸。

4、本发明提供基于上述飞蝗par-1基因合成的dsrna，其是由seq id no.9所示的正义链核苷酸和与seq id no.9互补的反义链核苷酸组成的双链rna。

5、本发明还提供用于合成所述dsrna的引物对，其核苷酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示。

6、本发明还提供了基于上述飞蝗par-1基因合成的dsrna的合成方法，包括以下步骤：

7、（1）基于seq id no.1所示的par-1基因序列，以提取的飞蝗卵巢总rna反转录成的cdna为模板，利用seq id no.4和seq id no.5所示的上、下游引物进行pcr扩增，得到464bp的pcr扩增产物，核苷酸序列如seq id no.6所示；

8、（2）将pcr扩增产物连接入pgem-t载体中获得重组质粒pgem–t–par-1；

9、（3）再以重组质粒pgem–t–par-1为模板，用如seq id no.7和seq id no.8所示的带有t7启动子序列的引物对进行pcr扩增得到用于合成dsrna的dna模板（即两端带有t7启动子的seq id no.6）；

10、（4）以带有t7启动子序列的dna为模板，使用t7ribomaxtmexpress rnai system（promega）试剂盒体外转录合成dsrna。

11、飞蝗par-1基因和/或飞蝗par-1基因的dsrna在制备飞蝗防治试剂中的应用。

12、飞蝗par-1基因和/或飞蝗par-1基因的dsrna在制备抑制飞蝗产卵的试剂中的应用。

13、进一步的，上述试剂中飞蝗par-1基因的dsrna的最小使用剂量为每只15μg。

14、本发明具有以下有益效果：

15、1、本发明在雌飞蝗体内注射基于飞蝗par-1基因的合成的dsrna能有效的抑制par-1的基因表达，产生抑制产卵和致死的效应，并且dsrna使用剂量小（15μg），致死率可达100%，效果显著。另外，用dsrna防治蝗虫，种属特异性强，不会对其他物种造成基因干扰；同时dsrna在自然环境中易降解，对生态环境友好。因此，鉴于本发明的高效性、特异性和安全性，在飞蝗害虫防治方面有广阔的应用前景，对保护我国农业生产、生态安全具有良好的经济效益。

16、2、注射dspar-1的处理组在注射后第1-2天出现死亡，至注射后第20天全部死亡，存活率为0%；且雌性飞蝗未死亡前，产卵能力受到极显著抑制，即注射dspar-1的处理组中产卵飞蝗的比例仅为1.2%，而对照组飞蝗100%产卵。

17、3、与现有技术相比，采用dsrna作为一种防治飞蝗的手段具有特异性、高效性、安全性的优点；同时，与基于其他基因为靶点的rna干扰相比，干扰par-1基因用于飞蝗防治的优势在于：（1）实现了飞蝗成虫阶段的100%致死。飞蝗为迁飞性害虫，其羽化为成虫后才具备迁飞能力，蝗灾暴发时，多为迁飞而来的大量成虫对作物造成危害，因此对飞蝗成虫的防治是飞蝗防治的重要一环。而现阶段飞蝗防治的其他基因多为作用于飞蝗幼虫的蜕皮导致的致死，对成虫的作用效果未知；（2）干扰par-1基因显著抑制了飞蝗产卵，保证了飞蝗死亡之前也不会产生下一代，有效控制了种群数量。

技术特征：

1.一种飞蝗par-1基因的dsrna，其特征在于：所述dsrna包括如seq id no.9所示的正义链核苷酸序列及与其反向互补的反义链核苷酸序列。

2.权利要求1所述的飞蝗par-1基因的dsrna的制备方法，其特征在于，步骤为：

3.根据权利要求2所述的飞蝗par-1基因的dsrna的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中引物dspar-1-f的核苷酸序列如seq id no.4所示、引物dspar-1-r的核苷酸序列如seq id no.5所示，扩增产物的核苷酸序列如seq id no.6所示。

4.根据权利要求3所述的飞蝗par-1基因的dsrna的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中引物dspar-1-t7-f的核苷酸序列如seq id no.7所示、引物dspar-1-t7-r的核苷酸序列如seq id no.8所示，目标片段的核苷酸序列为两端带有t7启动子的seq id no.6所示序列。

5.根据权利要求4所述的飞蝗par-1基因的dsrna的制备方法，其特征在于：所述体外转录是利用体外转录试剂盒实现的。

6.飞蝗par-1基因和/或飞蝗par-1基因的dsrna在制备飞蝗防治试剂中的应用。

7.飞蝗par-1基因和/或飞蝗par-1基因的dsrna在制备抑制飞蝗产卵的试剂中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述飞蝗par-1基因的orf序列如seqid no.1所示。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述飞蝗par-1基因的dsrna包括如seqid no.9所示的正义链核苷酸序列及与其反向互补的反义链核苷酸序列。

10.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述试剂中飞蝗par-1基因的dsrna的最小使用剂量为每只15μg。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及飞蝗的防治，特别是指飞蝗Partitioning defective 1（Par‑1）基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。通过将合成的Par‑1基因的dsRNA注射入雌飞蝗体腔后，可以特异性沉默飞蝗的Par‑1基因，导致雌飞蝗不产卵和大量致死，致死率100%，有效抑制了飞蝗的繁殖和生存，表明抑制Par‑1基因表达能够达到防治飞蝗的良好效果。由于本发明的高效性、特异性和安全性，在飞蝗害虫防治方面有广阔的应用前景，对保护我国农业生产、生态安全具有良好的经济效益。

技术研发人员：曾保娟,化梦轲,席玉玺,周树堂,郑洪远
受保护的技术使用者：河南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8