一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用

本发明属于分子标记辅助育种，具体涉及一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、西瓜[citrullus lanatus(thunb.)mansf.]是广泛种植于世界各地的葫芦科重要作物，果皮厚度是西瓜重要的农艺性状之一，是影响西瓜商品品质的重要性状。果皮厚度通常与果皮硬度、果皮韧性、耐贮运性和产量密切相关。在甜瓜中，已有报道表明果皮厚度对于产量的影响很大，但在西瓜中还未见相关报道。在番茄中，同样得出外果皮越厚越耐贮运的观点。目前，对于西瓜果皮厚度的精细测量方法存在较为繁琐、准确性欠佳的问题。caps分子标记是目前常见的且技术成熟的分子标记，其原理是酶切位点发生单碱基突变，从而导致酶切后的片段存在多态性。此类标记广泛分布于基因组中，操作比较简单，结果便于观察与识别，在相同物种不同材料中具有普遍适用性。因此，对能够用于研究西瓜果皮厚度的caps分子标记进行挖掘，并且运用到西瓜的种质资源筛选和分子育种过程中，对于明确西瓜果皮厚度遗传机制对西瓜耐贮运资源改良具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明公开了一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用，解决了目前对于西瓜果皮厚度的精细测量方法较为繁琐、准确性欠佳的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记，所述caps分子标记为如seq id no.1所示的核苷酸片段和如seq id no.2所示的核苷酸片段；所述seq id no.1与薄果皮性状紧密连锁，所述seq id no.2与厚果皮性状紧密连锁；所述薄果皮性状的果皮厚度为小于0.7cm，厚果皮性状的果皮厚度为大于等于0.7cm。

4、一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记的引物对，所述引物对包括如seq idno.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。

5、所述的引物对在鉴定西瓜果皮厚度中的应用，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组dna获得扩增产物，再利用限制性内切酶mspⅰ酶切扩增产物，根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度。

6、进一步的，所述西瓜基因组dna取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。

7、进一步的，所述根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。

8、一种鉴定西瓜果皮厚度的方法，所述方法包括如下步骤：

9、(1)提取待测西瓜的基因组dna；

10、(2)以步骤(1)获得的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，获得扩增产物；所述引物对包括如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物；

11、(3)利用限制性内切酶mspⅰ酶切扩增产物，根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度。

12、进一步的，步骤(3)所述根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。

13、上述的方法在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。

14、一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶mspⅰ；所述引物对包括如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。

15、所述试剂盒在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。

16、本发明在前期通过high-throughput sequencing技术，构建出西瓜果皮厚度基因池；使用graded-seq分析方法，在有结果的染色体区段内将snp位点开发为caps分子标记。进而使用2021年种植的250株f2代群体以及2022年种植的527株f2代群体进行遗传连锁分析，最终在西瓜基因组2号染色体末端约12.85kb的范围内获得了一个稳定的主效qtl。与此同时，根据两亲本重测序数据，开发caps分子标记，通过分子标记辅助选择的方法，在西瓜苗期即可对果皮厚度进行分子标记辅助选择，提高了筛选的准确性和效率，具有重要的理论和实践意义。

17、此外，本发明还依据上述技术，开发出了与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的caps分子标记，设计出了用于扩增该分子标记的引物对。具体做法为在定位区间内，依据母本及父本的snp位点差异，使用snp2caps软件得到存在酶切位点的差异序列，进行引物设计，从而获得能够用于鉴定西瓜果皮厚度的引物对。通过该引物对对西瓜幼苗基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物后，利用限制性内切酶mspⅰ对其进行酶切，根据所得到的酶切产物是否具有375bp的片段即可对西瓜是否具有厚果皮性状进行区分，达到了更快捷地和更准确地在西瓜苗期对西瓜果皮厚度进行鉴定的目的。

技术特征：

1.一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记，其特征在于，所述caps分子标记为如seqid no.1所示的核苷酸片段和如seq id no.2所示的核苷酸片段；所述seq id no.1与薄果皮性状紧密连锁，所述seq id no.2与厚果皮性状紧密连锁；所述薄果皮性状的果皮厚度为小于0.7cm，厚果皮性状的果皮厚度为大于等于0.7cm。

2.一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。

3.权利要求2所述的引物对在鉴定西瓜果皮厚度中的应用，其特征在于，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组dna获得扩增产物，再利用限制性内切酶mspⅰ酶切扩增产物，根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述西瓜基因组dna取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。

6.一种鉴定西瓜果皮厚度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。

8.权利要求6或7任意一项所述的方法在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。

9.一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶mspⅰ；所述引物对包括如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。

10.权利要求9所述的试剂盒在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域，解决了目前对于西瓜果皮厚度的精细测量方法较为繁琐、准确性欠佳的问题。本发明提供了一种与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的分子标记，该分子标记存在一处SNP位点上的变化，通过引物对对西瓜幼苗基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物后，利用限制性内切酶MspⅠ对其进行酶切，根据所得到的酶切产物是否具有375bp的片段即可对西瓜是否具有厚果皮性状进行区分。本发明所述的鉴定方法，操作简便，准确度高，为西瓜果皮厚度性状的分子鉴定提供了行之有效的工具。本发明所述的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒适用于西瓜分子标记辅助育种领域。

技术研发人员：赵正翔,韩文灏,杨天天,张鹏宇,张明充,鹿雪妍,闫娇蕊,栾非时,朱子成,刘宏宇,高鹏,刘识,王学征
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29