一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法及应用与流程

本发明涉及植物分子生物，具体涉及一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法及应用。

背景技术：

1、随着我国环保战略的推进，我国木材的产量一直呈现出下降的趋势。我国拥有大面积的杨树人工林，杨树作为重要的经济林，其木材在能源、建筑和造纸等行业具有十分重要的经济价值。与此同时人工林已经成为了世界木材加工和利用的主要来源，大力发展人工林是林学未来的发展趋势，也是森林资源结构和木材供应变化的必然结果。提高木材产量已经成为当前林木遗传育种的主要目标。杨树作为我国种植面积最大的人工林树种，承担着尤为重要的生态功能和经济功能。我国目前的木材产量不足，大多依赖进口，难以满足产业需要，在林木中需要鉴定出可提升木材产量的关键靶基因，从而实现杨树高效育种、提升种业创新能力。

2、木材的增粗主要来自于植物茎的次生发育，维管形成层向外分化形成韧皮部和向内分化形成木质部。从形成层释放出来的细胞经过体积增大，细胞壁加厚，最终发育为成熟的木质部细胞。木质部发育受到多种因子的共同调节，除植物激素、氮素、气象因子等，类受体激酶也在木材的发育过程中扮演重要角色。目前在林木发育中，富含亮氨酸重复受体样激酶ptoerecta基因是否参与调控木质部发育过程，仍然未知。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法；本发明的目的之二在于提供一种敲除ptoerecta基因在改良毛白杨生物性状中的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法，所述改良毛白杨生物性状为提高木质部细胞层数或提高木质部占比或促进茎杆变粗或提高地上部分生物量，包括如下步骤：

4、(1)构建植物敲除载体：在野生型毛白杨中对ptoerecta基因设计4个靶位点进行基因编辑，获得敲除载体。

5、(2)毛白杨的遗传转化：采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型毛白杨叶片；

6、(3)转基因植株分子检测：以转基因植株的基因组dna为模板，通过pcr扩增方法检测选出一些敲除ptoerecta的性状改良的转基因株系。

7、作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述对ptoerecta基因设计4个靶位的方法为：参照seq id no.1所示序列，选取ngg上游第20碱基是a或g的序列优先选为靶序列，设计了ptoerecta基因敲除载体的4个靶位点，并根据4个靶序列设计靶点引物接头，如下所示：

8、atu3bt1f:gtcaggggagatatcacctgcaat(seq id no.3)；

9、atu3bt1r:aaacattgcaggtgatatctcccc(seq id no.4)；

10、atu3dt2f:gtcacactgagtctgttctgcgcc(seq id no.5)；

11、atu3dt2r:aaacggcgcagaacagactcagtg(seq id no.6)；

12、atu6-1t3f:attgggggatggatccagtcagc(seq id no.7)；

13、atu6-1t3r:aaacgctgactggatccatcccc(seq id no.8)；

14、atu6-29t4f:attgtatcaggaataggcccttca(seq id no.9)；

15、atu6-29t4r:aaactgaagggcctattcctgata(seq id no.10)。

16、作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述敲除载体构建过程为将seq idno.3～10所示序列合成靶点接头引物，制备靶点接头；再通过2轮巢式pcr将靶点引物接头与grna表达盒进行连接；最后通过边切边连方式将grna表达盒连入pylcrispr/cas9-dh载体。

17、2、敲除ptoerecta基因在改良毛白杨生物性状中的应用。

18、作为本发明优选的技术方案，所述改良毛白杨生物性状为提高木质部细胞层数或提高木质部占比或促进茎杆变粗或提高地上部分生物量。

19、作为本发明优选的技术方案，编码所述ptoerecta基因的氨基酸序列为seq idno.2所示。

20、作为本发明更优选的技术方案，编码所述ptoerecta基因的核苷酸序列为seq idno.1所示。

21、本发明的有益效果在于：本发明公开了敲除富含亮氨酸重复受体样激酶的ptoerecta基因在提高毛白杨生物量中的应用，所述富含亮氨酸重复受体样激酶的ptoerecta基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，采用基因编辑方法，经根癌农杆菌侵染法转化野生型毛白杨后获得转基因植株，经后续阳性鉴定筛选出敲除ptoerecta的转基因株系的转基因株系。结果发现，与同时期野生型相比，敲除ptoerecta的转基因植株，茎杆变粗，地上生物量显著提高；并且与野生型相比敲除株系木质部层数层数更多，木质部占比更多。本发明提供的培育技术方法，培育出了高生物量的优质杨树品种。该发明对将来分子育种培养优良杨树具有重大意义。

技术特征：

1.一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法，其特征在于，所述改良毛白杨生物性状为提高木质部细胞层数或提高木质部占比或促进茎杆变粗或提高地上部分生物量，包括如下步骤：

2.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述对ptoerecta基因设计4个靶位的方法为：参照seq id no.1所示序列，选取ngg上游第20碱基是a或g的序列优先选为靶序列，设计了ptoerecta基因敲除载体的4个靶位点，并根据4个靶序列设计靶点引物接头，如下所示：

3.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述敲除载体构建过程为将seq id no.3～10所示序列合成靶点接头引物，制备靶点接头；再通过2轮巢式pcr将靶点引物接头与grna表达盒进行连接；最后通过边切边连方式将grna表达盒连入pylcrispr/cas9-dh载体。

4.敲除ptoerecta基因在改良毛白杨生物性状中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改良毛白杨生物性状为提高木质部细胞层数或提高木质部占比或促进茎杆变粗或提高地上部分生物量。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，编码所述ptoerecta基因的氨基酸序列为seq id no.2所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，编码所述ptoerecta基因的核苷酸序列为seq id no.1所示。

技术总结
本发明公开了一种基于基因编辑技术改良毛白杨生物性状的方法及应用，属于植物分子生物技术，采用基因编辑方法，对PtoERECTA设计4个靶位点进行基因编辑，获得敲除载体，经根癌农杆菌侵染法转化野生型毛白杨后获得转基因植株，经后续阳性鉴定筛选出敲除PtoERECTA的转基因株系的转基因株系。结果发现，与同时期野生型相比，敲除PtoERECTA的转基因植株，茎杆变粗，地上生物量显著提高，并且木质部层数层数更多，木质部占比更多；本发明培育出了高生物量的优质杨树品种，该发明对将来分子育种培养优良杨树具有重大意义。

技术研发人员：罗克明,罗雨薇,付小康,许长征
受保护的技术使用者：西部（重庆）科学城种质创制大科学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/29