GV型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株JEV-XZ-E5及其制备方法和应用

本发明涉及分子生物学，尤其涉及gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乙型脑炎(je)是乙型脑炎病毒(jev)引起的一种重要人畜共患病，主要由culex蚊子在宿主中传播。猪和鸟类是其中间宿主对维持、放大和传播感染很重要，而人类和马是其终末宿主。je主要在亚太地区流行，有30多亿人面临感染风险。大约20％-30％的je病例是致命的，30％-50％的幸存者有明显的神经后遗症。jev是一种属于黄病毒家族的单股正链rna病毒。它的基因组长度约为11kb，包含一个开放阅读框，编码约3432个氨基酸。翻译后，共编码3种结构蛋白(c、m和e)及7种非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。结构蛋白在病毒生命周期、确定毒性和诱导免疫反应中发挥着重要作用。特别是，e蛋白有助于受体介导的内吞作用和低ph触发的膜融合，并被认为在确定毒性和抗原性以及中和抗体的激发中发挥重要作用。

2、jev根据e基因和基因组序列分为5个基因型(i至v)。基因型iii(giii)历来是je的主要基因型，也是亚洲大部分地区的主要基因型。近年来，基因型i(gi)取代了giii，成为一些亚洲国家最常孤立的基因型。基因型v(gv)(muar株)最初于1952年在新加坡从一名起源于马来西亚muar的患者身上分离出来，并且是50多年来唯一已知的gv毒株。近年来，gv正在重新出现并蔓延到新的地理区域。

3、接种疫苗是控制je感染的最有效方法。目前许可的疫苗，如弱毒的sa14-14-2疫苗，来自giii毒株。考虑到gv型jev的发展，必须评估现有疫苗的交叉保护功效。然而，基于giii型jev的疫苗不能对新发的gv型jev提供足够水平的保护，不能诱导产生针对gv型jev的高水平的中和/保护抗体。因此，当前的giii型衍生的je疫苗可能无法提供足够水平的gv型jev保护。目前仍缺乏能够高效、安全的防控gv型乙型脑炎病毒病疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5，该弱毒疫苗株jev-xz-e5通过gv型乙型脑炎病毒xz2012株进行反向遗传操作获得，对gv型乙型脑炎病毒具有免疫原性和保护效果，可更好地应用于研制预防gv型乙型脑炎病毒病疫苗。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5，cdna序列如seq id no.24所示。

4、本发明还提供了所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)将gv型乙型脑炎病毒xz2012株的cdna序列分段扩增，然后将获得的各dna片段分别克隆至载体，并通过融合pcr获得含有转录启动子的弱毒疫苗株jev-xz-e5的全长cdna；

6、(2)将获得的全长cdna经体外转录、细胞转染，即获得乙型脑炎病毒弱毒疫苗株jev-xz-e5的感染性克隆毒株。

7、作为优选，步骤(1)所述gv型乙型脑炎病毒xz2012株的cdna序列分段获得的dna片段包括：第1-2477位核酸片段、第2478-5352位核酸片段、第5353-8187位核酸片段以及第8188-109832位核酸片段。

8、作为优选，在融合pcr过程中，对所述第1-2477位核酸片段中e基因进行pcr定点突变。

9、作为优选，突变的位点包括e基因的第47位、第107位、第123位、第138位和第176位氨基酸位点。

10、作为优选，所述e基因的第47位氨基酸位点的突变引物为jev-e47f和jev-e47r，所述jev-e47f的序列如seq id no.14所示，所述jev-e47r的序列如seq id no.15所示；所述e基因的第107位氨基酸位点的突变引物为jev-e107f和jev-e107r，所述jev-e107f的序列如seq id no.16所示，所述jev-e107r的序列如seq id no.17所示；所述e基因的第123位氨基酸位点的突变引物为jev-e123f和jev-e123r，所述jev-e123f的序列如seq id no.18所示，所述jev-e123r的序列如seq id no.19所示；所述e基因的第138位氨基酸位点的突变引物为jev-e138f和jev-e138r，所述jev-e138f的序列如seq id no.20所示，所述jev-e138r的序列如seq id no.21所示；所述e基因的第176位氨基酸位点的突变引物为jev-e176f和jev-e176r，所述jev-e176f的序列如seq id no.22所示，所述jev-e176r的序列如seq idno.23所示。

11、本发明还提供了一种核酸分子，包含所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5的cdna序列，并在所述cdna序列的5’端设有转录启动子。

12、作为优选，所述转录启动子为t7启动子。

13、本发明还提供了所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5、所述核酸分子在制备预防gv型乙型脑炎病毒病疫苗中的应用。

14、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

15、本发明技术方案中所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5，通过gv型乙型脑炎病毒xz2012株进行反向遗传操作获得，该弱毒疫苗株对gv型乙型脑炎病毒具有免疫原性和保护效果；所述弱毒疫苗株不仅能用于研制新型乙型脑炎病毒疫苗，同时还为进一步研究乙型脑炎病毒的基因组结构、功能以及和病毒宿主相互作用机理提供重要的研究工具。

技术特征：

1.一种gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5，其特征在于，cdna序列如seq id no.24所示。

2.权利要求1所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述gv型乙型脑炎病毒xz2012株的cdna序列分段获得的dna片段包括：第1-2477位核酸片段、第2478-5352位核酸片段、第5353-8187位核酸片段以及第8188-109832位核酸片段。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在融合pcr过程中，对所述第1-2477位核酸片段中e基因进行pcr定点突变。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，突变的位点包括e基因的第47位、第107位、第123位、第138位和第176位氨基酸位点。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述e基因的第47位氨基酸位点的突变引物为jev-e47f和jev-e47r，所述jev-e47f的序列如seq id no.14所示，所述jev-e47r的序列如seq id no.15所示；

7.一种核酸分子，其特征在于，包含权利要求1所述gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5的cdna序列，并在所述cdna序列的5’端设有转录启动子。

8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述转录启动子为t7启动子。

9.权利要求1或权利要求2-6任一项所述制备方法制得的gv型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株jev-xz-e5、权利要求7或8所述的核酸分子在制备预防gv型乙型脑炎病毒病疫苗中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域。本发明提供了一种GV型乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株JEV‑XZ‑E5及其制备方法，利用GV型乙型脑炎病毒XZ2012株进行反向遗传操作获得，所述弱毒疫苗株JEV‑XZ‑E5的cDNA序列如SEQ ID NO.24所示。本发明还提供了一种包含所述弱毒疫苗株JEV‑XZ‑E5的cDNA序列的核酸分子，该核酸分子在所述cDNA序列的5’端设有转录启动子。本发明所述弱毒疫苗株JEV‑XZ‑E5对GV型乙型脑炎病毒具有免疫原性和保护效果，为预防GV型乙型脑炎病毒病疫苗的研发进一步提供思路。

技术研发人员：魏建超,马志永,夏琦琦,张妍,张海龙,邱亚峰,李宗杰,李蓓蓓,刘珂,邵东华
受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12