细胞核基因ITS序列在鉴定韭菜子中的应用的制作方法

本发明涉及一种细胞核基因its序列在鉴定韭菜子中的应用，属于药物分析。

背景技术：

1、韭菜子为百合科植物韭allium tuberosum rottl.ex spreng.的干燥成熟种子，性温，味辛、甘，归肝、肾经，具有温补肝肾，壮阳固精等功效，用于治疗肝肾亏损，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，白浊带下。全国各地均产，主产于山东、河南、河北、山西、安徽等地。现代药理研究表明，韭菜子具有改善性功能、改善免疫调节、抗氧化和抗衰老等多方面的作用。其主要含有生物碱类、甾体皂苷类、核酸和核苷类及脂肪酸类成分。对韭菜子药品市场进行调研，发现除正品外，常有将性状与其相似的葱子(百合科植物葱allium fistulosuml.的干燥成熟种子)充当或掺入韭菜子销售。因此，亟需建立一种韭菜子药材和葱子的专属性鉴别方法，对于提升韭菜子药材标准、质量控制和确保临床准确、安全用药具有重要的实际意义。

2、目前关于韭菜子与市场上常见的伪品的鉴别方法区分研究暂不充分，朱婕妤等人研究了韭菜子及其伪品的鉴别，通过药材性状、粉末显微特征和薄层色谱区分韭菜子及其混淆品，但该研究中薄层色谱鉴别方法中的区别斑点rf值超出药典规定范围，不能作为鉴别依据。周运梅等人研究了韭菜子与混用品的鉴别，通过在显微镜下观察两者的横切面与粉末来辨别真伪，但是粉末的显微鉴别分辨率低、耗时耗力。因此亟需一种能够快速鉴定韭菜子及其混伪品的方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供细胞核基因its序列在鉴定韭菜子中的应用。本发明的第二目的是提供细胞核基因its序列在区分韭菜子和葱子的应用。

2、技术方案：本发明所述的细胞核基因its序列在鉴定韭菜子中的应用，所述细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c、第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g。

3、其中，基于所述细胞核基因its序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq idno.1-2所示。

4、本发明所述的细胞核基因its序列在区分韭菜子和葱子的应用，所述细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c或t、第221位核苷酸为a或t、第222位核苷酸为t或a、第444位核苷酸为g或c、第445位核苷酸为g或t、第446位核苷酸为c或g、第448位核苷酸为t或g、第449位核苷酸为g或a。

5、其中，当所述细胞核基因its的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c、第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g时，所述应用中的待测药材为韭菜子；当所述细胞核基因its的第220位核苷酸为t、第221位核苷酸为t、第222位核苷酸为a、第444位核苷酸为c、第445位核苷酸为t、第446位核苷酸为g、第448位核苷酸为g、第449位核苷酸为a时，所述应用中的待测药材为葱子。

6、本发明所述的鉴定韭菜子的方法，包括以下步骤：采集待测样品，提取待测样品中的dna作为模板，基于细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c、第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g设计特异性引物对，进行pcr扩增，当pcr产物电泳后出现271bp片段，则待测样品为韭菜子，反之则不是韭菜子；所述特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。

7、其中，所述pcr检测的体系包括2×m5 hiper plus taq hifi pcr mix(with bluedye)、特异性引物、dna模板、无菌水。

8、其中，所述pcr检测的反应程序为95℃预变性3min，94℃变性30s、60～64℃退火30s、72℃延伸30s共25～35个循环，72℃终延伸5min。

9、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明根据韭菜子的细胞核基因its序列设计的特异性引物对在pcr检测中可以准确鉴别出韭菜子，鉴定方法稳定，检测时间短，特异性强，且不受药材性状影响，可以对药材粉末进行准确鉴别。

技术特征：

1.细胞核基因its序列在鉴定韭菜子中的应用，其特征在于，所述细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c，第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g。

2.根据权利要求1所述的细胞核基因its序列在鉴定韭菜子中的应用，其特征在于，基于所述细胞核基因its序列设计的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。

3.细胞核基因its序列在区分韭菜子和葱子的应用，其特征在于，所述细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c或t、第221位核苷酸为a或t、第222位核苷酸为t或a、第444位核苷酸为g或c、第445位核苷酸为g或t、第446位核苷酸为c或g、第448位核苷酸为t或g、第449位核苷酸为g或a。

4.根据权利要求3所述的细胞核基因its序列在区分韭菜子和葱子的应用，其特征在于，当所述细胞核基因its的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c，第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g时，所述应用中的待测药材为韭菜子；当所述细胞核基因its的第220位核苷酸为t、第221位核苷酸为t、第222位核苷酸为a、第444位核苷酸为c、第445位核苷酸为t、第446位核苷酸为g、第448位核苷酸为g、第449位核苷酸为a时，所述应用中的待测药材为葱子。

5.一种鉴定韭菜子的方法，其特征在于，包括以下步骤：采集待测样品，提取待测样品中的dna作为模板，基于细胞核基因its序列的genbank登陆号为om658519.1的第220位核苷酸为c、第221位核苷酸为a、第222位核苷酸为t、第444位核苷酸为g、第445位核苷酸为g、第446位核苷酸为c，第448位核苷酸为t、第449位核苷酸为g设计特异性引物对，进行pcr扩增，当pcr产物电泳后出现271bp片段，则待测样品为韭菜子，反之则不是韭菜子；所述特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示。

6.根据权利要求5所述的鉴定韭菜子的方法，其特征在于，所述pcr检测的体系包括2×m5 hiper plus taq hifi pcr mix(with blue dye)、特异性引物、dna模板、无菌水。

7.根据权利要求5所述的鉴定韭菜子的方法，其特征在于，所述pcr检测的反应程序为95℃预变性3min，94℃变性30s、60～64℃退火30s、72℃延伸30s共25～35个循环，72℃终延伸5min。

技术总结
本发明公开了一种细胞核基因ITS序列在鉴定韭菜子中的应用。所述细胞核基因ITS序列的GenBank登陆号为OM658519.1的第220位核苷酸为C、第221位核苷酸为A、第222位核苷酸为T、第444位核苷酸为G、第445位核苷酸为G、第446位核苷酸为C、第448位核苷酸为T、第449位核苷酸为G。本发明根据韭菜子的细胞核基因ITS序列设计的特异性引物对在PCR检测中可以准确鉴别出韭菜子，鉴定方法稳定，检测时间短，特异性强，且不受药材性状影响，可以对药材粉末进行准确鉴别。

技术研发人员：钱润,周海琴,程梦娟,张开雪,曹杰楠,海丰,胡剑虹,陈盛君,李松
受保护的技术使用者：江阴天江药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12