尿路上皮癌标志物及应用、引物组、高特异性的试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及生物，特别是涉及一种尿路上皮癌标志物及应用、引物组、高特异性的的试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、尿路上皮癌(urothelial carcinoma,uc)是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，包括位于下尿路的膀胱和尿道恶性肿瘤及位于上尿路的肾盂和输尿管恶性肿瘤，其中约90％为膀胱uc。

2、uc的术前定性诊断主要依靠输尿管镜检查和病理活检，目前的无创尿液诊断技术如尿脱落细胞学和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)等检查的敏感性较低(分别为：40-50％和60-70％)，难以满足临床需求。最近，广州市基准医疗有限责任公司(简称基准医疗)开发的基于人onecut2和vim基因的尿液dna甲基化qpcr检测试剂盒(专利号：cn110872631b)，在两组疑似膀胱uc患者(一组192人，另一组98人)中进行检测(clin epigenet.2021,13:91)，敏感性分别为88.1％和91.2％，特异性分别为89.7％和85.7％。接着，该试剂盒又在两组疑似上尿路uc(一组153人，另一组75人)中进行检测(中华泌尿外科杂志，2023，44(10)：725-730)，敏感性分别为83.0％和85.2％，特异性分别为92.0％和85.7％。总之，该试剂盒检测uc的敏感性和特异性都在80-90％，远高于传统的无创技术(脱落细胞学和fish)而且操作方便，价格便宜，有望在临床应用。

3、但是，该试剂盒最大的缺点是特异性不高，只有80-90％，容易造成假阳性。而uc的特点是发病隐匿；患者即使出现血尿，也有80％不是uc。因此特异性不高必然会导致大量的误诊，尤其无法用于常规体检。例如，临床上有1000个血尿患者待查，如果特异性80％的话，就有200个患者被误诊为uc；如果特异性90％的话，也有100个患者被误诊为uc。至于常规体检，假设10万个人参与检测，特异性90％的话，就有1万人被误诊为uc。这在实际应用中绝对不能接受的。

4、为此，我们重新设计了人onecut2和vim基因的检测标志物区域，并制作成试剂盒，得到的试剂盒临床实验结果显示特异性显著改善。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一尿路上皮癌标志物及其应用，其可以用于尿路上皮癌风险的检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价。本发明也提供了适用于尿路上皮癌检测的引物组、高特异性的试剂盒和检测方法。

2、本发明的第一方面提供了一种用于尿路上皮癌检测的标志物，所述标志物由cg指示的共甲基化区域的seq id no.1和seq id no.2的组成，或由与seq id no.1和seq idno.2完全互补序列的组成。

3、采用一代测序技术分析23个人的甲基化谱，发现现有技术cn110872631b中的检测位点正好落在非癌症与癌症的甲基化临界区域，因此容易造成假阳性，为为了提高检测的特异性，同时为了避开基准医疗的专利，我们重新设计了人onecut2和vim基因的检测区域seq id no.1和seq id no.2。

4、本发明的第二方面提供了用于检测上述的标志物甲基化水平的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价尿路上皮癌的检测系统中的应用，所述检测系统包括：检测试剂、试剂盒或检测装置。

5、本发明的第三方面提供了一种检测尿路上皮癌的引物组，所述引物组包括：

6、针对seq id no.1的引物组1，其由核苷酸序列如seq id no.3的正向引物和核苷酸序列如seq id no.4的反向引物，以及核苷酸序列如seq id no.5的探针组成；

7、针对seq id no.2的引物组2，其由核苷酸序列如seq id no.6的正向引物和核苷酸序列如seq id no.7的反向引物以及核苷酸序列如seq id no.8的探针组成。

8、在一种或多种实施方式中，所述引物组还包括：针对内参基因actb的内参actb引物组，其由核苷酸序列如seq id no.9的正向引物和核苷酸序列如seq id no.10的反向引物，以及核苷酸序列如seq id no.11的探针组成。

9、本发明的第四方面，还提供了一种高特异性的尿液甲基化检测尿路上皮癌的试剂盒，包括上述的引物组1和引物组2。

10、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒还包括上述的内参actb引物组。

11、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂中的至少1种。

12、在一种或多种实施方式中，所述试剂盒为qpcr试剂盒。

13、本发明的第五方面提供了一种高特异的尿液甲基化qpcr检测尿路上皮癌的检测方法，包括如下步骤：

14、(1)提取尿液样本中的dna；

15、(2)对提取的dna样品进行转化；

16、(3)样品dna检测：使用上述的引物组，或试剂盒，以actb为内参基因，对转化后的dna样本进行三重qpcr检测，并根据检测数据判定检测结果；

17、判定标准如下：①当内参基因ct值ct actb≤33时，检测结果有效；ct actb＞33，检测结果无效；②阈值设定：以如权利要求1所述的标志物的任一ct值与内参基因的actb的ct差值δct作为判断依据，样本年龄＜70岁，阈值δct为10；每增多10岁，阈值δct减少0.5。

18、在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中采用亚硫酸氢盐进行转化。

19、在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，qpcr检测反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，60℃15秒，于60℃收集荧光信号，45个循环。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明通过重新设计人onecut2和vim基因的检测区域，检测特异性高，本发明的检测试剂盒，通过结合标志物检测区域，对引物对及探针的设计及其组合设计，大大提高了检测特异性，在210个疑似uc个体(80个uc和130个非uc)中进行检测，结果敏感性仍然有85％，而特异性却达到100％，未出现假阳性情况，特别适合于常规体检应用。

技术特征：

1.一种用于尿路上皮癌检测的标志物，其特征在于，所述标志物由cg指示的共甲基化区域的seq id no.1和seq id no.2的组成，或由与seq id no.1和seq id no.2完全互补的序列组成。

2.用于检测如权利要求1所述的标志物甲基化水平的试剂在制备用于检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价尿路上皮癌的检测系统中的应用，所述检测系统包括：检测试剂、试剂盒或检测装置。

3.一种检测尿路上皮癌的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

4.根据权利要求3所述的检测尿路上皮癌的引物组，其特征在于，所述引物组还包括：针对内参基因actb的内参actb引物组，其由核苷酸序列如seq id no.9的正向引物和核苷酸序列如seq id no.10的反向引物，以及核苷酸序列如seq id no.11的探针组成。

5.一种高特异性的尿液甲基化检测尿路上皮癌的试剂盒，其特征在于，包括如权要求3-4任一项所述的引物组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸转化试剂中的至少1种。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为qpcr试剂盒。

8.一种高特异性的尿液甲基化qpcr检测尿路上皮癌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，qpcr检测反应程序为：95℃30秒；95℃15秒，60℃15秒，于60℃收集荧光信号，45个循环。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用亚硫酸氢盐进行转化。

技术总结
本发明涉及尿路上皮癌标志物及应用、引物组、高特异性的的试剂盒和检测方法；所述标志物包括由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合或其完全互补序列的组合。本发明的检测试剂盒，大大提高了检测特异性，在210个疑似UC个体，结果敏感性仍然有85％，而特异性却达到100％，未出现假阳性情况，特别适合于常规体检应用。

技术研发人员：黄仲曦,杨玉志,徐亚文,周子颖,廖佳靖,王莉婷,钱羿君,李家玲,庄思娴,彭晏宁,冯显柱
受保护的技术使用者：广州中鑫基因医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/26