一种胶滴法构建髓核类器官的方法及其构建的椎间盘类器官与应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种胶滴法构建髓核类器官的方法及构建的椎间盘类器官与应用。

背景技术：

1、当前我国老龄化程度日益严重，与老龄化相伴而来的则是年龄相关性慢性疾病发病率和发病数量不断升高。椎间盘退行性疾病是一类常见的年龄相关性慢性疾病，可以引起腰背痛等症状，严重可致患者劳动力丧失甚至残疾，给家庭和社会带来沉重的负担。多种因素可以导致椎间盘退行性疾病的发生，其共同特点是细胞数量减少和功能减退，细胞外基质含量下降且比例失调等。而髓核作为椎间盘的重要组成部分，其自身衰老在椎间盘退变过程中起着非常关键的作用。

2、近年来，类器官技术是再生领域的研究热点，是指人类成体干细胞或多能干细胞经体外3d培养后,自诱导形成的带有特定结构和功能的细胞簇。这一类器官在构造与功能上与人体真实器官高度相似,并可在体外持续稳定传代培养，这为椎间盘的再生修复提供了新的可能。

3、传统髓核/椎间盘组织工程的设计原则缺乏生物材料对椎间盘形成过程中不同阶段、多种细胞、特异微环境等多维度、多层次的有序调控,无法有效诱导空间化髓核/椎间盘微环境特征,构建效果有限，无法应用于临床。

4、因此，理论上髓核类器官可以作为一类新的再生修复方法，通过替换已经退变和损伤的髓核实现临床上的再生修复，将有可能极大地改善椎间盘退行性疾病的发生和发展。

技术实现思路

1、本发明主要提供一种可用于构建髓核类器官的方法及其构建的髓核类器官与应用，可用于椎间盘退行性疾病发病机制研究和实现椎间盘再生修复。

2、本发明提供的技术方案优选如下：

3、本发明提供的胶滴法构建髓核类器官的方法，主要包含步骤：

4、1)收集人正常椎间盘髓核组织；

5、2)髓核组织提取及清洗；

6、3)髓核细胞的消化、提取、培养和传代，得到p2髓核干细胞；

7、4)采用流式细胞术鉴定髓核干细胞；

8、5)髓核类器官的构建，包括，pdms u型底构建；芯片设计和制造；类器官的构建，其类器官的构建如下；

9、①取p2髓核干细胞，用0.25％胰蛋白酶含edta溶消化，至伪足消失，加入完全培养基中止消化；

10、②收集细胞混悬液并离心，去除上清液，加入完全培养基重悬；

11、③按照8×105细胞密度进行成球培养，计算的细胞数所对应的细胞混悬液的量；

12、④离心，培养细胞；

13、⑤培养细胞组装成球，完全培养基培养，将自组装类器官体进行转移至芯片内持续髓核诱导分化培养基培养；

14、⑥配置髓核诱导分化培养基；

15、⑦将髓核诱导分化培养基及相关因子进行配置，分装备用；

16、⑧髓核干细胞经诱导分化为髓核类器官；

17、6)髓核类器官的鉴定。

18、优选地，步骤2)所述髓核组织提取及清洗包含步骤：经椎间孔镜从侧方入路手术方式，镜下可见到中心区髓核组织呈胶冻状半透明状，外周纤维环呈白色柔韧状，摘取突出髓核组织。

19、优选地，步骤3)所述髓核细胞的消化包含步骤：将髓核样本组织从组织保存液中取出置于培养皿中，用含1％青-链霉素的1×dpbs稀释组织保存液，去除髓核外组织，提取髓核组织，将碎片化髓核组织转移至t25细胞培养瓶内，根据组织量加入相应的含钙镁hbss液、cacl2溶液以及ⅱ型胶原酶，混匀后孵育消化。

20、优选地，步骤4)所述髓核细胞提取包含步骤：组织块经ⅱ型胶原酶消化后形成浑浊样细胞混悬液，通过细胞滤网进行过滤，去除细胞聚集物或团块；过滤后的细胞混悬液转移至无菌离心管内离心，去除上清液，向离心管内加入人骨髓间充质干细胞完全培养基并吹打混匀，铺板为12孔板的一个孔。

21、优选地，步骤5)所述的pdms u型底构建为：

22、用琼脂糖填充于离心管底，配制pdms基质胶，充分搅拌混匀，负压条件下抽出气泡；将适量pdms基质胶倾倒单个孔内，利用琼脂糖进行pdms倒膜，制作出pdms u型底，紫外线照射一段时间后备用；

23、本发明还提供由上述的方法构建的髓核类器官。

24、本发明所述的髓核类器官在椎间盘生理和病理模型的构建中的应用。

25、本发明所述的髓核类器官在治疗椎间盘损伤、退变的药物筛选和验证、人损伤和退变椎间盘的生物学修复和临床移植再生修复中的应用。

26、本发明所述的胶滴法构建髓核类器官，以较小成本和简单方式模拟髓核结构和生理功能，复制其生理和病理特点,用于发病机制研究和实现椎间盘再生修复。进而通过分子生物学、单细胞测序分析髓核类器官的生物学特性，通过动物椎间盘退变模型评估髓核类器官修复效果，为促进椎间盘退变有序再生修复提供全新治疗策略，为椎间盘退变研究基础研究和临床应用提供理论依据和实验支持。

27、采用本技术诱导体系可以实现髓核干细胞自组装、自分化为髓核类器官，模拟髓核/椎间盘结构和生理功能,复制其生理和病理特点,用于发病机制研究和促进髓核/椎间盘再生修复。

技术特征：

1.一种胶滴法构建髓核类器官的方法，其特征在于，包含步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2)髓核组织提取及清洗包含步骤：经椎间孔镜从侧方入路手术方式，镜下可见到中心区髓核组织呈胶冻状半透明状，外周纤维环呈白色柔韧状，摘取突出髓核组织。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3)髓核细胞的消化包含步骤：将髓核样本组织从组织保存液中取出置于培养皿中，用含1％青-链霉素的1×dpbs稀释组织保存液，去除髓核外组织，提取髓核组织，将碎片化髓核组织转移至t25细胞培养瓶内，根据组织量加入相应的含钙镁hbss液、cacl2溶液以及ⅱ型胶原酶，混匀后孵育消化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4)髓核细胞提取包含步骤：组织块经ⅱ型胶原酶消化后形成浑浊样细胞混悬液，通过细胞滤网进行过滤，去除细胞聚集物或团块；过滤后的细胞混悬液转移至无菌离心管内离心，去除上清液，向离心管内加入人骨髓间充质干细胞完全培养基并吹打混匀，铺板为12孔板的一个孔。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的pdms u型底构建为：

6.一种由权利要求1所述的方法构建的髓核类器官。

7.权利要求6所述的髓核类器官在椎间盘生理和病理模型的构建中的应用。

8.权利要求7所述的髓核类器官在治疗椎间盘损伤、退变的药物筛选和验证、人损伤和退变椎间盘的生物学修复和临床移植再生修复中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药领域，涉及一种胶滴法构建髓核类器官的方法及其构建的髓核类器官与应用，本发明具体是通过胶滴法诱导人髓核干细胞自组装成为髓核类器官。该髓核类器官可用于椎间盘生理和病理模型的构建、治疗椎间盘损伤和退变的药物筛选和验证、人损伤和退变椎间盘的生物学修复和临床移植再生修复等。

技术研发人员：孙超,陶真真,熊承杰,徐峰,陈璞,陈涛,刘雳邦玺,牛康衡,王康恒,赵稳,王宇闻,雷蕾
受保护的技术使用者：中国人民解放军中部战区总医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22