一株用绿色荧光蛋白标记NS1蛋白的重组蓝舌病毒

本发明属于基因工程领域，具体涉及一株用绿色荧光蛋白标记ns1蛋白的重组蓝舌病毒。

背景技术：

1、蓝舌病是由蓝舌病毒(bluetongue virus，btv)感染羊、牛、鹿等反刍动物引起的一种严重的烈性传染病，世界动物卫生组织(woah)将其列为法定通报的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。btv在分类上属于呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(orbivirus)，是一种由库蠓(culicoides)传播的虫媒病毒，目前已发现至少存在29种不同的血清型，不同血清型之间不能交叉免疫。

2、btv粒子为二十面立体对称，无囊膜，其基因组由10个(s1～s10)分节段的线性双链rna(dsrna)组成。btv基因组编码7种结构蛋白(vp1～vp7)和4种非结构蛋白(ns1、ns2、ns3/ns3a、ns4)；btv粒子具有双层衣壳，vp2和vp5组成外层衣壳，内层衣壳由vp3和vp7组成。btv脱去外层衣壳后形成病毒核心粒子，3种酶蛋白vp1、vp4、vp6位于核心粒子内部；其中非结构蛋白ns1蛋白由s6基因编码，是所有btv编码蛋白中表达量最高的蛋白，约占病毒总蛋白的25％。ns1蛋白在btv感染的细胞质中可以多聚体形式形成微管结构，这些微管的直径约为52nm、长约1000nm，这是btv感染细胞后最显著的特征之一，微管在btv感染细胞后2～4小时出现且存在于整个感染复制周期。但目前对形成微管的生物学功能并不了解。不同血清型btv的ns1蛋白的氨基酸序列高度保守，同源性99％以上。

3、目前关于btv定量检测方法有qrt-pcr、噬斑实验、免疫荧光、tcid50等方法。然而，由于btv已经发现29种血清型，每种血清型中不同病毒分离株的基因也有差异，因此，qrt-pcr法需要设计合成特异性引物和探针，成本较高，且可能会出现非特异性扩增。免疫荧光法需要制备或购买病毒特异性的抗体，易出现非特异性结合，而且不能对感染细胞中的活病毒进行实时定量和定位。噬斑实验和tcid50方法操作过程繁琐，技术要求比较高，增加了实验操作产生的误差，准确性和可重复性比较低。

4、近年来，对于病毒的可视化定量主要基于对编码荧光蛋白(fluorescentprotein，fp)的重组病毒进行定量，即通过基因工程的手段将表达gfp的基因与病毒蛋白基因融合，可以实现对病毒的特定蛋白进行荧光标记。btv的基因组由10个大小不等(0.8-3.9kb)的双链rna组成，每个基因容纳外源基因的能力非常有限，由于荧光蛋白分子量通常在27ku～37ku，在病毒基因上插入荧光蛋白基因并成功表达是困难的。

5、本发明意外发现在蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位氨基酸后插入绿色荧光蛋白后不影响蓝舌病毒的组装，重组病毒可以被成功拯救，构建获得的重组蓝舌病毒btv-1s6-156egfp与野生型蓝舌病毒相比，重组病毒ns1蛋白的表达不受影响且能够正确表达增强型绿色荧光蛋白，但不再形成病毒样微管结构，可用于btv感染细胞后ns1蛋白未形成病毒样微管结构的相关研究，并且可用于btv的中和抗体测定实验以及可视化定量检测。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明意外发现在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位氨基酸后插入绿色荧光蛋白后，成功构建获得了表达绿色荧光蛋白的重组蓝舌病毒btv-1s6-156egfp；所述重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒相比，重组病毒ns1蛋白的表达不受影响且能够正确表达增强型绿色荧光蛋白，但不再形成病毒样微管结构，可用于btv感染细胞后ns1蛋白未形成病毒样微管结构的相关研究、btv的可视化定量检测、btv的病毒中和实验和抗病毒药物筛选等。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一株绿色荧光蛋白标记的重组蓝舌病毒，所述重组蓝舌病毒是在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位和157位氨基酸之间插入绿色荧光蛋白后获得。

3、优选地，所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

4、优选地，所述野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

5、优选地，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、第二方面，本发明提供了一种用绿色荧光蛋白标记的重组蓝舌病毒的构建方法，所述方法为：通过基因工程手段在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位和157位氨基酸之间插入绿色荧光蛋白，利用反向遗传技术进行病毒拯救后获得。

7、优选地，所述方法包括以下步骤：

8、(1)在野生型蓝舌病毒s6基因cds序列的第468位碱基后插入增强型绿色荧光蛋白的基因序列，构建获得含有egfp基因序列的s6基因转录质粒；

9、(2)分别构建野生型蓝舌病毒基因s1-s5、s7-s10的转录质粒，体外转录成mrna转录本；

10、(3)将步骤(1)所述含有egfp荧光蛋白基因序列的s6基因转录质粒以及步骤(2)所述的mrna转录本共转染细胞，筛选获得绿色荧光蛋白标记的重组蓝舌病毒。

11、优选地，所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

12、优选地，所述野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

13、第三方面，本发明提供了上述第一方面所述方法构建获得的重组蓝舌病毒。

14、第二方面，本发明提供了上述第一方面或如第三方面任一所述的重组蓝舌病毒具有如下任一所述的用途：

15、(1)在蓝舌病毒ns1蛋白未形成病毒样微管结构情况下的应用；

16、(2)在蓝舌病毒的中和实验及可视化定量检测中的应用；

17、(3)在蓝舌病毒抗病毒药物筛选中的应用。

18、本发明的有益效果是：(1)本发明意外发现只有在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位和157位氨基酸之间插入绿色荧光蛋白，可拯救获得绿色荧光蛋白标记的重组蓝舌病毒；且ns1蛋白可显示绿色荧光，可用于ns1蛋白在细胞中的动态表达和未形成病毒样微管的相关研究；(2)而且所述重组蓝舌病毒改变了原有野生型蓝舌病毒ns1蛋白形成的病毒样微管结构；(3)重组蓝舌病毒还可以应用于btv的可视化定量检测、btv的病毒中和实验和抗病毒药物筛选等。

技术特征：

1.一株用绿色荧光蛋白标记ns1蛋白的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述重组蓝舌病毒是在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位和157位氨基酸之间插入绿色荧光蛋白序列后获得。

2.如权利要求1所述的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

3.如权利要求2所述的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

4.如权利要求1所述的重组蓝舌病毒，其特征在于，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如sqe id no.1所示。

5.一种用绿色荧光蛋白标记的重组蓝舌病毒的构建方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的156位157位氨基酸之间插入绿色荧光蛋白，并利用反向遗传技术进行病毒拯救后获得。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

9.如权利要求4～8任一所述方法构建获得的重组蓝舌病毒。

10.如权利要求1～3或权利要求9任一所述的重组蓝舌病毒具有如下任一所述的用途：

技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及一株用绿色荧光蛋白标记NS1蛋白的重组蓝舌病毒。本发明通过在野生型蓝舌病毒非结构蛋白NS1的156位和157位氨基酸之间插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)序列，构建获得了NS1重组突变蓝舌病毒BTV‑1S6‑156eGFP；所述重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒相比，重组的NS1蛋白能够正确表达增强型绿色荧光蛋白，但不再形成病毒样微管结构，可用于BTV感染细胞后NS1蛋白未形成病毒样微管结构的相关研究，同时可用于BTV的病毒中和实验及病毒含量的可视化定量检测等。

技术研发人员：独军政,宋昱庆,刘学春,田占成,关贵全,罗建勋,殷宏
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17