夹板连接接头及其构建测序文库的方法与流程

本发明涉及基因测序文库，具体涉及夹板连接接头及其构建测序文库的方法。

背景技术：

1、基于ctdna指导的mrd(微小/可测量残留病灶或分子残留病灶)评估，比传统的临床或影像学方法提前鉴定出有肿瘤复发风险的患者，并在预测预后和疗效评估等方面具有重要价值。mrd评估要求极高的检测灵敏度，建库方法的选择在mrd的研究中至关重要，针对mrd研究中的血浆样本而言，由于其提取后的cfdna量少且突变频率较低，研究和发展更先进的建库技术，提高模板利用率和检出灵敏度，是当前肿瘤研究领域的重要方向。

2、目前存在多种建库方法，如双链建库和单链建库。商业上双链建库的检出限(lod)大致在0.5％左右，但双链建库的方法存在一些局限，在接头连接过程中依赖双链末端的完整性，需要进行末端修复后才能连接，在末端修复与连接的过程中会导致一些模板片段的丢失，从而降低了模板的利用率，这一问题限制了双链建库在极低检出限方面的应用。商业上的单链建库方法，则是在3'端连接接头时引入随机碱基或延伸末端(tdt)，这意味着在生物信息学分析中需要进行特殊的数据处理，通常需要切除这些额外的碱基，这可能会导致数据量的减少。

3、因此，亟需开发一种新的构建测序文库和测序方法，可进一步提高检出灵敏度和准确性。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种夹板连接接头及其构建测序文库的方法，采用该夹板连接接头对单链核酸进行测序文库构建，可提高目的片段模板的利用率，通过对目的片段模板直接添加umi序列，可提高后续测序过程中检出的灵敏度和准确性。

2、在本发明的第一方面，本发明提出了一种夹板连接接头。根据本发明的实施例，所述夹板连接接头包括第一接头；所述第一接头包括第一连接链和第一夹板链；所述第一连接链的5’端到3’端依次为固定序列、umi序列和第一测序序列，所述第一测序序列为read2测序引物序列；所述第一夹板链的5’端到3’端依次为第一测序序列互补序列、spacer修饰基团、夹板序列和第一随机序列，所述夹板序列与固定序列反向互补，所述第一随机序列与目的片段的3’端反向互补配对。

3、本发明的夹板连接接头，通过将第一连接链连接到目的片段的3’端得到连接产物，从而可将umi序列标记在目的片段上，后续可通过线性扩增放大该连接产物，其可保持线性扩增的合成链均直接来自于初始模板链，可减少合成链中的错误、避免后续pcr扩增中产物链作为模板进行多次扩增导致的碱基错配堆叠，且通过umi的标记可在后续用于去除后续建库pcr和测序过程中产生的错误。由此，采用上述夹板连接接头获得的测序文库，在后续测序过程中可提高检出的灵敏度和准确性。

4、在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一方面所述的夹板连接接头。由前可知，第一方面所述的夹板连接接头可用于构建测序文库。由此，采用含有上述夹板连接接头的试剂盒可构建测序文库，得到的测序文库合成链信息直接来源于原始模板，避免了错配积累，可提高后续测序过程中的灵敏度和准确性。

5、在本发明的第三方面，本发明提出了一种单链构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述法包括：1)将第一接头和第二接头分别连接至第一单链的两端，得到接头产物；2)将所述接头产物进行index扩增处理，得到测序文库；其中，所述第一接头和第二接头来源于第一方面所述的夹板连接接头或第二方面所述的试剂盒。根据本发明的方法，通过将第一连接链连接到含有目的片段的初始单链核酸序列的3’端得到连接产物，从而可将umi序列标记在对含有目的片段的初始单链核酸序列上，后续可通过线性扩增放大该连接产物，其可保持线性扩增的合成链均直接来自于初始模板链，可减少合成链中的错误、避免后续pcr扩增中产物链作为模板进行多次扩增导致的碱基错配堆叠，且通过umi的标记可在后续用于去除后续建库pcr和测序过程中产生的错误。由此，采用上述方法获得的测序文库，在后续测序过程中可提高检出的灵敏度和准确性。

6、在本发明的第四方面，本发明提出了一种单链测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是采用第三方面所述的方法获得的。本发明的测序文库的核酸信息直接来源于原始模板，避免了错配积累，可提高后续测序过程中检出的灵敏度和准确性。

7、在本发明的第五方面，本发明提出了一种单链测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第三方面所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行质检并上机测序；以及基于测序结果，得到目的片段的序列信息。由此，可对上述得到的测序文库进行测序，得到目的片段的序列信息。

8、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种夹板连接接头，其特征在于，包括第一接头；

2.根据权利要求1所述的夹板连接接头，其特征在于，进一步包括第二接头；

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的夹板连接接头。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括index扩增引物对；

5.一种单链构建测序文库的方法，其特征在于，包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一单链是通过对双链进行第一变性处理获得的；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括：

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，对所述index扩增处理得到预文库进行杂交捕获，得到测序文库。

9.一种测序文库，其特征在于，所述测序文库是采用权利要求5～8任一项所述的方法获得的。

10.一种单链测序方法，其特征在于，包括：

技术总结
本发明公开了一种夹板连接接头，其包括第一接头；所述第一接头包括第一连接链和第一夹板链；所述第一连接链的5’端到3’端依次为固定序列、UMI序列和第一测序序列，所述第一测序序列为Read2测序引物序列；所述第一夹板链的5’端到3’端依次为第一测序序列互补序列、spacer修饰基团、夹板序列和第一随机序列，所述夹板序列与固定序列反向互补，所述第一随机序列与目的片段的3’端反向互补配对。本发明的夹板连接接头含有UMI，通过UMI的标记可在后续用于去除后续建库PCR和测序过程中产生的错误。由此，采用上述夹板连接接头获得的测序文库在后续测序过程中，可提高检出的灵敏度和准确性。

技术研发人员：胡娟,王洋,吴亚林,黄韵祺
受保护的技术使用者：杭州瑞普基因科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/18