一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌

本发明属于基因工程，具体涉及一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌。

背景技术：

1、黑曲霉是一种广泛分布于粮食、果蔬产品中的病原菌，极易导致霉变，不仅造成经济损失还严重危害人类健康。目前主要采用物理法和化学法对黑曲霉进行防控，但这些方法很难发挥理想的效果，局限性较大，甚至还会产生食品感官品质遭破坏、农药残留及真菌耐药性增加等问题。随着人们对生态环境保护意识的不断提高和生物技术的飞速发展，对黑曲霉防控的研究热点已转向具有环保、安全、高效且无污染等特点的生物法。芽胞杆菌作为一类具有广谱抑菌活性的益生菌，在抑制黑曲霉的应用中具有极大的开发潜力。

2、解淀粉芽胞杆菌hz-12对黑曲霉具有抑制作用。解淀粉芽胞杆菌可分泌多种抑菌物质，其中脂肽已被证明对真菌具有突出的抑制作用。外源添加脂肽的前体氨基酸会提高脂肽的产量，增强其抗菌能力。经过大量筛选发现阻断脯氨酸降解会影响解淀粉芽胞杆菌对黑曲霉抑制效果。本发明首次发现：通过敲除解淀粉芽胞杆菌hz-12的ycgm基因，阻断脯氨酸降解，显著提高了其对黑曲霉的抑制作用，并获得了一株可高效抑制黑曲霉的工程菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌，通过基因敲除技术对解淀粉芽胞杆菌hz-12的脯氨酸降解相关基因ycgm进行敲除，使其对黑曲霉的抑制作用显著提高。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

3、一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述工程菌是敲除解淀粉芽胞杆菌(bacillus amyloliquefaciens)hz-12脯氨酸降解基因ycgm所得，具体构建方法如下：

4、1)以解淀粉芽胞杆菌hz-12的基因组dna为模板，pcr扩增ycgm基因的上游同源臂和ycgm基因的下游同源臂；

5、2)通过重叠延伸pcr将ycgm基因的上游同源臂和ycgm基因的下游同源臂连接到一起，构成同源臂融合片段；

6、3)采用xbai和bamhi限制性内切酶对同源臂融合片段和质粒t2(2)-ori进行双酶切，得到酶切基因片段和线性质粒片段，经dna连接酶进行连接，得到敲除质粒t2(2)-δycgm；

7、4)将敲除质粒t2(2)-δycgm转入解淀粉芽胞杆菌hz-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

8、5)将阳性转化子在45℃条件下转接培养基数次后，进行菌落pcr检测，得到ycgm基因的上游同源臂或ycgm基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌hz-12基因组dna产生完全单交换的阳性单交换结合子菌株；

9、6)挑选阳性单交换结合子菌株接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养基，pcr法筛选得到敲除了ycgm基因的解淀粉芽胞杆菌hzδycgm。

10、进一步地，所述步骤1)中ycgm基因的上游同源臂的引物序列如seq idno.4和5所示，ycgm基因的下游同源臂的引物序列如seq id no.6和7所示。

11、上述方法制备的解淀粉芽胞杆菌工程菌hzδycgm在高效抑制黑曲霉中的应用：将hzδycgm发酵液加入黑曲霉平板的孔中，28℃培养5d后测量抑菌圈大小，结果表明，解淀粉芽胞杆菌工程菌hzδycgm对黑曲霉的抑制能力相较于原始菌提升了39％。

12、本发明人首次尝试构建敲除脯氨酸降解相关基因ycgm的敲除载体，成功得到了缺失ycgm基因的解淀粉芽胞杆菌基因工程菌株，显著提高了对黑曲霉抑制效果，为抑制黑曲霉提供了一种新策略。

13、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

14、1.我们对解淀粉芽胞杆菌hz-12采用了无痕基因敲除的方法进行基因工程改造，没有引入任何外源基因，不会产生其它附属物质，对人体和其他生物无害。

15、2.本发明首次发现敲除ycgm基因可显著提高解淀粉芽胞杆菌对黑曲霉的抑制效果，与原始菌解淀粉芽胞杆菌hz-12相比，通过本发明构建得到的解淀粉芽胞杆菌hzδycgm对黑曲霉抑制效果提高了39％。

技术特征：

1.一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是敲除解淀粉芽胞杆菌（bacillus amyloliquefaciens）hz-12脯氨酸降解基因ycgm所得。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌工程菌，其特征在于，敲除的基因ycgm的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.权利要求1所述解淀粉芽胞杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤1）中ycgm基因的上游同源臂的引物序列如seq id no.4和5所示，ycgm基因的下游同源臂的引物序列如seq id no.6和7所示。

5.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌工程菌在制备抑制黑曲霉的制剂中的应用。

技术总结
本发明提供了一株高效抑制黑曲霉的解淀粉芽胞杆菌工程菌，通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌HZ‑12的基因组内脯氨酸降解相关基因ycgM基因，成功得到了缺失ycgM基因的解淀粉芽胞杆菌HZΔycgM，显著提高了解淀粉芽胞杆菌对黑曲霉的抑菌活性。相对于解淀粉芽胞杆菌HZ‑12来说，本发明所构得的工程菌株对黑曲霉的抑制效果提高了39%。

技术研发人员：魏雪团,张岱源,叶长文,黄阔
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/6/2