一种金鱼造血器官坏死病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及金鱼造血器官坏死病毒的检测方法，特别涉及一种金鱼造血器官坏死病毒的双重taqman探针法荧光定量pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus，gfhnv)，即鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2，cyhv-2)，是异疱疹病毒科鲤病毒属的成员，可以感染异育银鲫、金鱼及鲫的其他变种，最适发病水温15℃-25℃。该病一旦暴发，导致死亡率可达80％以上。为有效防控，建立切实有效的检测方法尤为重要。当前由于缺乏针对该病原的敏感细胞系和抗体，通常使用分子生物学方法来检测。因此，建立快速灵敏实用的金鱼造血器官坏死病毒pcr检测技术，不仅有助于及时对金鱼造血器官坏死病毒进行诊断、监控和防治，而且也可应用于养殖量更大的鲫属鱼类造血器官坏死病的诊断与监控。

2、目前，对金鱼造血器官坏死病毒的分子生物学检测主要包括常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，lamp)和荧光定量pcr反应等技术方法。但这些方法有的耗时长，操作繁琐，有的准确度不高，会形成气溶胶等污染，有的使用sybr green染料法或仅使用单一taqman探针进行荧光定量pcr反应，灵敏度和特异性难以兼顾。其中taqman探针法荧光定量pcr技术巧妙的利用了pcr技术的dna高效扩增、taqman探针与dna模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，选用双重探针可以同时检测病原的2个基因片段的特异性位点，相较单一探针具有更高的准确性和特异性，尤其在鉴别同属近缘不同病毒时更具优势，克服了单探针法在检测同属近缘病毒时可能存在的假阳性及常规pcr检测准确度不高和灵敏度低的不足，极大地提高了检测的准确性、特异性和灵敏性。当前，荧光定量pcr技术已广泛应用于各种病毒的检测，但还未见双重taqman探针法荧光定量pcr应用于金鱼造血器官坏死病毒检测的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种特异性高，简便快捷的金鱼造血器官坏死病毒的双重taqman探针法荧光定量pcr检测试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种金鱼造血器官坏死病毒的双重taqman探针法荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性引物和探针，所述特异性引物和探针序列如下：

4、正向引物f1：5’-tggaagcggtgtaggtcaca-3’；

5、正向引物f2：5’-tacgcacaccagagatccga-3’；

6、反向引物r1：5’-aatacccgcacagcgaagac-3’；

7、反向引物r2：5’-aacccggacgagcgtagaaa-3’；

8、荧光探针q1：5’-6-fam-accgagtccaaccgacctctcggttct-bhq1-3’；

9、荧光探针q2：5’-vic-accgttgacggaccacggctgcaaa-bhq1-3’。

10、进一步的，所述试剂盒包括荧光定量pcr反应液、阴性对照、阳性对照；

11、所述荧光定量pcr反应液配方为：2×定量pcr预混液10μl，正向引物f10.4μl，正向引物f20.4μl，反向引物r10.4μl，反向引物r20.4μl，荧光探针q10.4μl，荧光探针q20.4μl，双蒸水6.6μl；

12、所述阳性对照为puc57-gfhnv，其是将seq id no:9所示的靶序列连入puc57质粒获得；

13、所述阴性对照为无菌水。

14、进一步的，所述试剂盒的使用方法为：以待测样品的dna为模板，利用权利要求2所述的试剂盒进行荧光定量pcr。

15、进一步的，所述荧光定量pcr的反应体系总体积为20μl，包含1μl dna模板和19μl荧光定量pcr反应液。

16、进一步的，所述荧光定量pcr的反应程序为：95℃25s；95℃5s，60℃35s，共40循环。

17、本发明的显著优点在于：

18、本发明以金鱼造血器官坏死病毒gfhnv中的dna-dependent dnapolymerase催化亚基基因片段和dna helicase基因片段保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了两对特异性引物及对应的taqman探针，建立了金鱼造血器官坏死病毒双重taqman探针法荧光定量pcr检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒，经实验，该试剂盒的检测灵敏度为10拷贝/μl，上机运行1小时内即可得到准确的结果，无非特异性扩增，适用于gfhnv感染的苗种、成鱼的检疫，及水环境中病原的监测。此外，本发明创新性的将2个靶基因间隔一定无关序列构建到同一个质粒上，充分模拟该病毒的生物学形态(所有病毒基因在同一条病毒dna链上)，定性和定量结果更为准确。

技术特征：

1.一种金鱼造血器官坏死病毒的双重taqman探针法荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含特异性引物和探针，所述特异性引物和探针序列如下：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括荧光定量pcr反应液、阴性对照、阳性对照；

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的使用方法为：以待测样品的dna为模板，利用权利要求2所述的试剂盒进行荧光定量pcr。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量pcr的反应体系总体积为20μl，包含1μl dna模板和19μl荧光定量pcr反应液。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量pcr的反应程序为：95℃25s；95℃ 5s，60℃ 35s，共40循环。

技术总结
本发明涉及金鱼造血器官坏死病毒的检测方法，特别涉及一种金鱼造血器官坏死病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。具体的，本发明以金鱼造血器官坏死病毒的DNA‑dependent DNA polymerase催化亚基基因片段和DNA helicase基因片段保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了两对特异性引物及对应的TaqMan探针，建立了金鱼造血器官坏死病毒双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒。

技术研发人员：郭睿,杨小强,蔡雷鸣,王伟,马鸿媚,潘国诚,吴林烨
受保护的技术使用者：福州市海洋与渔业技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/27