毛竹果胶乙酰酯酶基因PePAE6及其提取方法和应用与流程

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6及其提取方法和应用。

背景技术：

1、果胶是一类富含半乳糖醛酸的分支杂多糖，其主要存在于高等植物的ⅰ型初生壁和胞间层中，在ⅱ型初生壁和次生壁中也有少量存在。果胶由四类主要组成成分，即聚半乳糖醛酸(homogalacturonan，hg)、鼠李半乳糖醛酸i(rhamnogalacturonan i，rgi)、鼠李半乳糖醛酸聚糖ⅱ(rhamnogalacturonanⅱ，rgⅱ)和木葡聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan，xga)；上述四类主要组成成分主要参与组成基质，使得初生壁具有弹性且可随细胞的伸长而延长，还参与细胞壁的重塑以及细胞的扩张，进一步影响或改变植株个体发育表型以及生理生化过程。

2、果胶含量在双子叶植物初生壁中的占比很大，约占干物重的三分之一；在单子叶植物中的草本植物则含量相对较低，例如禾本科植物。不过，在单子叶植物基因组中仍存在有大量的参与果胶合成及修饰的基因，这表明果胶同样在单子叶植物的个体生长发育过程中起重要作用；非糖基团是修饰果胶的常见基团，比如甲酯(methylesters，me)和乙酰酯(acetylesters，ae)等，这些基团使果胶以高度酯化的状态合成；并且这些修饰基团修饰得到的各类修饰酶调节植物组分的酯化修饰程度，改变植物粘性、疏水性和带电特性等理化性质，从而调节植物细胞壁整体诸如硬度、延展性和孔隙度等结构性质及参与植物细胞壁动态调节活动，使之响应各类刺激和释放信号物质从而适应自身不同组织的不同生长发育阶段。其中，乙酰酯对果胶进行乙酰化修饰是植物细胞壁中多糖组分的一种普遍的修饰形式，也是果胶的一种重要修饰类型。

3、作为可以裂解乙酰酯键使果胶去乙酰化的植物果胶，乙酰酯酶(pectinacetylesterase，pae；e.c.3.1.1.6)很大程度上决定了果胶及细胞壁的乙酰化水平。根据cazy数据库，pae属于碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，ces)的ce13家族。随着第一个植物pae从甜橙(citrus sinensis)中分离得到后，有关研究已经在拟南芥(arabidopsis thaliana)、杨树(populustrichocarpa)、茶树(camellia sinensis)等物种中广泛展开。比如，拟南芥中12个pae基因atpae成员划分为3个分支，atpaes的9个保守motifs中的3个(gcsxg、nxaydxwq和hcq)推测可能与催化机理关联，还发现atpaes的表达模式与果胶甲酯酶、果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶等相关的基因具有一致性，但具体功能不明；对拟南芥中报道突变体pae8和pae9的研究表明，pae8和pae9蛋白同时发挥作用以去除拟南芥叶片果胶形成过程中三分之一的细胞壁乙酰酯，导致细胞壁乙酰酯积累量大幅度减少，进一步表现为花茎高度的降低；同时对于杨树、茶树、甜橙等pae的研究表明，植物pae在不同物种间具有高保守性，仅具有单独的、典型的pae保守结构域；此外，在杨树中发现pae的表达受到co2和氮浓度水平的调节；在甜橙中cspae2能提高植株对杆菌溃疡病的抗性，表明植物pae具有功能多样性。

4、作为经济价值高的禾本科草本植物之一，竹类具有可食用的笋芽和高度木质化的竹秆。作为竹类中的毛竹，其是速生植物的代表，毛竹的快速生长与细胞壁的重塑以及细胞壁多糖性质的动态优化密切相关。而果胶作为细胞壁网络结构基质物质，是细胞膨胀和伸长过程不可或缺的成分，是植物能够快速生长的基础条件之一。目前对于竹子细胞壁果胶乙酰化和去乙酰化的机制尚无相关现有技术，pae对细胞壁整体及由此导致的植物生理生化活动的影响也尚属空白。因此，鉴定竹子中的pae并揭示其分子特性，对阐明pae在竹子生长发育中的生物学功能具有重要意义。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明从毛竹中提取了果胶乙酰酯酶基因pepae6，并发现该基因具有降低植株细胞壁果胶乙酰化水平、促进植株果胶积累、提高植株光合能力以及促进植株生长的功能，可以将该基因作为目标基因通过转基因手段培育细胞壁果胶乙酰化水平低、果胶含量高、光合能力强以及生长快的植株。

2、为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

3、本发明一方面提供了一种毛竹(phyllostachys edulis)果胶乙酰酯酶基因pepae6，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

4、本发明另一方面提供一种分离的核酸分子，其编码如seq id no:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

5、本发明再一方面提供一种生物材料，其包括本发明中的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或本发明中的分离的核酸分子。

6、本发明再一方面提供一种本发明中的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或本发明中的分离的核酸分子或本发明中的生物材料在以下应用中的一种或多种应用：(a)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在降低植株细胞壁果胶乙酰化水平中的应用；(b)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株果胶积累中的应用；(c)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株光合作用中的应用；(d)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株生长中的应用。

7、本发明再一方面提供一种本发明中的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或本发明中的分离的核酸分子或本发明中的生物材料在培育转基因植株中的应用。

8、本发明再一方面提供一种本发明中的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6的提取方法，其包括：(1)以毛竹叶为材料，提取rna，并反转录成cdna作为模板；(2)使用引物对进行pcr扩增得毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6，引物对的上游引物如seq id no:3所示，引物对的下游引物如seq id no:4所示。

9、本发明有益效果至少包括：本发明中的毛竹的果胶乙酰酯酶基因pepae6具有降低植株细胞壁果胶乙酰化水平、促进植株果胶积累、提高植株光合能力、促进植株生长的功能；将毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6导入水稻中进行验证，得到转基因水稻植株较野生型水稻植株的细胞壁果胶乙酰化水平更低、果胶积累量更多、叶片光合能力更强、植株生长更快更好。

技术特征：

1.毛竹(phyllostachys edulis)果胶乙酰酯酶基因pepae6，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no:1所示。

2.分离的核酸分子，其特征在于，其编码如seq id no:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.生物材料，其特征在于，包括权利要求1所述的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或权利要求2所述的分离的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，生物材料为基因表达盒、基因表达载体、基因克隆载体、工程菌或工程细胞。

5.权利要求1所述的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或权利要求2所述的分离的核酸分子或权利要求3或4所述的生物材料在以下应用中的一种或多种应用：(1)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在降低植株细胞壁果胶乙酰化水平中的应用；(2)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株果胶积累中的应用；(3)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株光合作用中的应用；(4)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在促进植株生长中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用(3)包括以下应用中的一种或多种：(a)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在提升植株净光合速率中的应用；(b)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在提升植株胞间二氧化碳浓度中的应用；(c)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在提升植株气孔导度中的应用；或应用(4)包括以下应用中的一种或多种：(a)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在增加植株地上部生长量中的应用；(b)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在增加植株地下部生长量中的应用；(c)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在增加植株鲜重中的应用；(d)毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或分离的核酸分子或生物材料在增加植株干重中的应用。

7.权利要求1所述的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6或权利要求2所述的分离的核酸分子或权利要求3或4所述的生物材料在培育转基因植株中的应用。

8.根据权利要求5至7中任一项权利要求所述的应用，其特征在于，植株为毛竹或水稻。

9.权利要求1所述的毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6的提取方法，其特征在于，包括：(1)以毛竹叶为材料，提取rna，并反转录成cdna作为模板；(2)使用引物对进行pcr扩增得毛竹果胶乙酰酯酶基因pepae6，引物对的上游引物如seq id no:3所示，引物对的下游引物如seq id no:4所示。

技术总结
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种毛竹果胶乙酰酯酶基因PePAE6及其提取方法和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因具有降低植株细胞壁果胶乙酰化水平、促进植株果胶积累、提高植株光合能力、促进植株生长的功能；将毛竹果胶乙酰酯酶基因PePAE6导入水稻中进行验证，得到转基因水稻植株较野生型水稻植株的细胞壁果胶乙酰化水平更低、果胶积累量更多、叶片光合能力更强、植株生长更快更好。

技术研发人员：高志民,林泽铭,朱成磊,刘燕,李慧,李天阔,狄小琳,王江飞,杨克彬,孙化雨
受保护的技术使用者：国际竹藤中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/27