一种钩端螺旋体耐热保护剂的制作方法

本发明属于微生物保护剂领域，具体是涉及一种钩端螺旋体耐热保护剂。

背景技术：

1、钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的一种急性人兽共患传染病。我国是钩端螺旋体菌株资源最丰富的国家之一，为钩体疫苗的生产和流行病检测提供了重要的研究基础，但由于菌株的生长特性，给菌株的保存带来了不小的阻碍。目前，保存钩端螺旋体菌株的方法主要有室温保存，低温保存，液氮保存等几种，其中室温保存存在菌株毒力下降、菌种污染，费时费力，成本高等缺点；低温以及液氮保存成本较高，而且会导致菌种脱水和变性，也会影响菌种的复苏，以及复苏后的存活率，目前研究显示，低温冻存的效果和冻存时钩体的浓度，保存期，培养基，保护剂，冻存温度等诸多原因有关。为了确保长期获得稳定且高质量的钩体菌种，还需要深入探讨钩体菌种长期保存的方法和策略，找到一种稳定，省时，低成本的保存钩端螺旋体的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种钩端螺旋体的耐热保护剂。

2、为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种钩端螺旋体耐热保护剂，包括蛋白胨，纳米植物甾醇，丙酮酸钠，l-精氨酸，可溶性淀粉，海藻糖，维生素b12和二甲基亚砜。

4、进一步的，所述耐热保护剂组分包括5％～7％w/v蛋白胨，2％～3％w/v纳米植物甾醇，

5、1％～2％w/v丙酮酸钠，1％～2％w/v l-精氨酸，1％～2％w/v可溶性淀粉，2％～3％w/v海藻糖，1％～2％w/v维生素b12，3％～5％v/v二甲基亚砜。

6、进一步的，所述耐热保护剂的制备方法为：

7、1)称取蛋白胨，溶于注射用水中，连续搅拌至完全溶解,然后依次加入纳米植物甾醇、丙酮酸，l-精氨酸，连续搅拌至完全溶解，获得第一溶液；

8、2)称取可溶性淀粉于注射用水中，连续搅拌至完全溶解，然后依次加入海藻糖，维生素b12，连续搅拌至完全溶解，获得第二溶液；

9、3)将第一溶液和第二溶液等体积混合后定容，调节ph值至7.2～7.4，116℃高压灭菌20～30分钟或0.22μm滤器过滤除菌，获得第三溶液；

10、4)量取二甲基亚砜，加入第三溶液中，混合均匀即为耐热保护剂，2～8℃保存。

11、进一步的，所述耐热保护剂与钩端螺旋体菌液混合的比例为1:2～1:4。

12、进一步的，所述钩端螺旋体菌液的浓度为1×108～1×1010条/ml。

13、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

14、本发明提供的耐热保护剂可以确保在冻干过程中有效的保护钩端螺旋体的活性，保持菌种毒力及免疫原性，菌种的复苏和发酵效果良好，该保护剂配置方法简单，成本低，适合大规模生产，便于后续研究和生产使用。

15、纳米植物甾醇(nanoactive phytosterol)是一种新型的水溶性植物甾醇纳米脂质体制剂，植物甾醇(phytosterol)是一类对人体非常有益的天然生理活性物质，被誉为“生命的钥匙”，广泛存在于植物中。植物甾醇应用于动物研究上被发现具有抑制心血管疾病的功能；还具有抗癌、抗肿瘤、消炎、提高免疫、调节生长、抗病毒和抗氧化等作用。利用纳米传输系统(nds)开发的粒径小于30nm的植物甾醇纳米活性物，完全解决了植物甾醇溶解性问题，让植物甾醇稳定地包裹于纳米载体之中，能大幅增加吸收效率和生物利用度。

16、丙酮酸钠是一种最常见的丙酮酸盐，分子式为c3h3nao3，是一类内源性小分子物质，丙酮酸钠和丙酮酸均是天然存在于人体内，并参与全身各组织和器官的代谢。丙酮酸钠在医学上、诊断试剂以及医疗器械中被广泛用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。

17、l-精氨酸是一种有机化合物，分子式是c6h14n4o2，有一定解毒作用。其大量存在于鱼精蛋白等中，亦为各种蛋白质的基本组成，存在十分广泛，属于营养增补剂。

18、可溶性淀粉(solublestarch)，是淀粉经过氧化剂、酸、甘油、酶或其他方法处理而成的淀粉衍生物。可溶性淀粉无还原物质，化学性质稳定，能够提高药物的稳定性和溶解度，还能作为药物的载体，保护药物。

19、海藻糖，是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖，分子式为c12h22o11。海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

20、维生素b12又叫钴胺素，是一种含有3价钴的多环系化合物，是唯一含金属元素的维生素。维生素b12为红色结晶粉末，无嗅无味，溶于水，难溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿和乙醚，维生素b12是唯一的一种需要一种胃壁细胞分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素，参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。

21、二甲基亚砜(dmso)是一种含硫有机化合物，分子式为c2h6os，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”，dmso也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

技术特征：

1.一种钩端螺旋体耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂包括蛋白胨，纳米植物甾醇，丙酮酸钠，l-精氨酸，可溶性淀粉，海藻糖，维生素b12和二甲基亚砜。

2.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂组分包括5％～7％w/v蛋白胨，2％～3％w/v纳米植物甾醇，1％～2％w/v丙酮酸钠，1％～2％w/v l-精氨酸，1％～2％w/v可溶性淀粉，2％～3％w/v海藻糖，1％～2％w/v维生素b12，3％～5％v/v二甲基亚砜。

3.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂的制备方法为：

4.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂与钩端螺旋体菌液混合的比例为1:2～1:4。

5.根据权利要求4所述的一种钩端螺旋体耐热保护剂，其特征在于，所述钩端螺旋体菌液的浓度为1×108～1×1010条/ml。

技术总结
本发明提供一种钩端螺旋体耐热保护剂，该保护剂的组分包括5％～7％w/v蛋白胨，2％～3％w/v纳米植物甾醇，1％～2％w/v丙酮酸钠，1％～2％w/v L‑精氨酸，1％～2％w/v可溶性淀粉，2％～3％w/v海藻糖，1％～2％w/v维生素B12，3％～5％v/v二甲基亚砜。本发明提供的耐热保护剂可以确保在冻干过程中和冻干后一定时间内有效地保护钩端螺旋体的活性，保持菌种毒力及免疫原性，菌种的复苏和发酵效果良好，该保护剂配置方法简单，成本低，适合大规模生产，便于后续研究和生产使用。

技术研发人员：孔彩平,车艳杰,王甜,廖丽晶,张中宇,杨喆,王丹阳,陶伟杰,张辛铭,刘海霞
受保护的技术使用者：天津瑞普生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12