一种色素万寿菊遗传转化方法

本申请涉及植物遗传转化，尤其涉及一种色素万寿菊遗传转化方法。

背景技术：

1、色素万寿菊为菊科一年生草本植物，因其花瓣叶黄素含量较高，现已是叶黄素提取的理想材料，因叶黄素对保护视力具有重要作用，色素万寿菊也逐渐受人们青睐，对色素万寿菊的遗传转化探索有着重要价值。

2、植物遗传转化的相关常用技术是（1）农杆菌介导法，依赖植物离体再生技术，操作复杂，需要进行组织培养；（2）农杆菌浸种法，无需植物组织培养、只需要成熟的种子，克服了离体再生和体细胞突变的问题。其中农杆菌浸种法并未在色素万寿菊上使用过。

3、因此，需采用一种较为简单的方法，无需组织培养的方法对色素万寿菊种子进行遗传转化。

技术实现思路

1、为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本申请提供一种色素万寿菊遗传转化方法，本申请利用农杆菌浸种法对色素万寿菊种子进行遗传转化，缩短了转化时间。

2、本申请提供一种色素万寿菊遗传转化方法，包括以下步骤：

3、（1）制备重悬液：从原农杆菌菌液中培养出的单菌落移入含有 25mg/l的利福平和50mg/l的卡那霉素的固体yeb培养基中进行培养，从培养完成后的菌液中选取呈阳性的菌液进行保存作为目标农杆菌菌液，以使用目标农杆菌菌液制备重悬液；

4、（2）种子预处理：将去除种皮的色素万寿菊种子置于无菌水中进行催芽；

5、（3）农杆菌浸种转化：步骤（2）中完成催芽的色素万寿菊种子移入步骤（1）制备的重悬液中，加入silwettl-77和乙酰丁香酮，摇匀后进行超声波处理，再经二次真空处理进行培养，从而完成对色素万寿菊种子的浸种转化以实现色素万寿菊遗传转化；

6、（4）草铵膦筛选浓度的确定：使用乙醇、次氯酸钠和无菌水对实现色素万寿菊遗传转化的色素万寿菊种子进行消毒处理；将消毒处理后的色素万寿菊种子置于草铵膦溶液的无菌滤纸上。

7、可选的，重悬液的浓度为od6000.5-1.3；两次真空处理中第一次真空处理的时间为5~15min，第二次真空处理的时间为30s。

8、进一步的，当重悬液的浓度为od6000.9时，第一次真空处理的时间为10min。

9、可选的，草铵膦溶液的浓度为10-200mg/l。

10、进一步的，草铵膦溶液的浓度为200mg/l。

11、可选的，silwettl-77的质量分数为0.1%，乙酰丁香酮在重悬液中的浓度为20mg/l。

12、可选的，步骤（3）中第二次真空处理后的种子在温度为25 ℃、转速为150 r/min浸染4 h，在14 h/d光照下进行培养。

13、可选的，使用所述目标农杆菌菌落制备重悬液，具体包括:

14、对目标农杆菌菌液以6000 r/min的转速离心10min，将离心后的目标农杆菌菌液弃除上清液后，用液体ms培养基进行重悬，制备得到所述重悬液。

15、可选的，步骤（1）中目标农杆菌菌液与已灭菌50%的甘油等体积混合后，进行液氮速冻放置在-80℃中保存。

16、其中：上述yeb培养基指的是发根农杆菌培养基，为现有技术公开的常规培养基；上述silwettl-77是上海原叶生物公司提供的硅系表面活性剂；上述草铵膦溶液来源于上海沪震实业有限公司。

17、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

18、本申请的有益技术效果：

19、1.本申请可直接采用成熟的种子，不需要组织培养过程，合理控制浸染浓度、真空时间、造伤方式和草铵膦浓度筛选以实现色素万寿菊遗传转化以实现色素万寿菊的遗传转化，得到具有草铵膦抗性的植株。

20、2.利用本申请方法得到的遗传转化后的种子的mda、pod、sod和根系活力四种活性的提高，从而使得使用上述种子进行培育得到的幼苗具有株高和鲜重的生理指标提升，同时，去种皮可提高转化效率。

技术特征：

1.一种色素万寿菊遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重悬液的浓度为od600 0.5-1.3；所述两次真空处理中第一次真空处理的时间为5~15min，第二次真空处理的时间为30s。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当所述重悬液的浓度为od600 0.9时，所述第一次真空处理的时间为10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述草铵膦溶液的浓度为10-200mg/l。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述草铵膦溶液的浓度为200mg/l。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述silwettl-77的质量分数为0.1%，所述乙酰丁香酮在重悬液中的浓度为20mg/l。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中第二次真空处理后的种子在温度为25 ℃、转速为150 r/min浸染4 h，在14 h/d光照下进行培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中目标农杆菌菌液与已灭菌50%的甘油等体积混合后，进行液氮速冻放置在-80℃中保存。

技术总结
本申请公开了一种色素万寿菊遗传转化方法。色素万寿菊遗传转化方法包括：从原农杆菌菌液中培养出的单菌落移入含有25mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的固体YEB培养基中进行培养，从培养完成后的菌液中选取呈阳性的菌液进行保存作为目标农杆菌菌液，以使用目标农杆菌菌液制备重悬液；将去除种皮的色素万寿菊种子置于无菌水中进行催芽后移入重悬液中，加入silwettL‑77和乙酰丁香酮，摇匀后进行超声波处理，再经二次真空处理，从而完成对色素万寿菊种子的浸种转化以实现色素万寿菊遗传转化。该申请利用农杆菌浸种法实现色素万寿菊的遗传转化，只需要要成熟的种子，无需进行组织培养，是一种简单有效的实现色素万寿菊遗传转化的方式。

技术研发人员：黄望启,牛善策,陈秀华,张艺萍,孟超,许凤,王丽花,钱绍方,雷正松,杨秀梅,蒋亚莲,张丽芳,苏艳,赵阿香
受保护的技术使用者：云南省农业科学院花卉研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29