一种新型核酸固相合成载体的制备方法与流程

本发明涉及材料化学合成领域，尤其涉及一种新型核酸固相合成载体的制备方法。

背景技术：

1、对于核酸如dna，rna的化学合成，广泛采用利用亚磷酸酰胺法的固相合成工艺，此方法通常使用的固相载体有大孔玻璃珠(cpg)、交联聚苯乙烯树脂等。使用cpg用于核酸的固相合成，通常使用硅烷偶联剂首先将胺基引入到粒子表面，然后将具有核酸裂解用可降解连接剂的核苷与所述胺基键合。但cpg作为一种无机硅氧基载体，表面具有大量的羟基，亲水性强，且羟基保护基在合成过程中易脱落，会影响核酸的合成效率和质量。而交联聚苯乙烯载体表面含有大量苯环基团，导致载体表面疏水，经过有机溶剂充分淋洗后可彻底去除表面残留的水分，减少水分对核酸的合成的影响，且合成过程中不易产生错误的序列，产物纯度较高。但以上这两类载体孔径均较小，难有孔径大于200nm的载体，而在核酸的固相合成过程中，由于合成试剂如核苷酸亚磷酰胺分子扩散速度慢而引起核酸合成效率差；且因为核苷酸链一般带有负电荷，分子链接存在排斥作用，特别对于长序列的核酸序列，其在合成过程中长链核苷酸的三维空间结构较大，传统的上述颗粒球形状的cpg及聚苯乙烯微球载体越来越难于满足实际需求，因此开发出一种新型的超大孔的合成载体来大规模、低成本、高效率地合成载体，满足核酸药物市场的需求特有必要。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种新型核酸固相合成载体的制备方法，使用本发明中的核酸固相合成载体，可以提高寡核苷酸合成过程的溶剂、原料的传质效率，从而提高合成效率，有利于降低寡核苷酸的生产成本。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种新型核酸固相合成载体的制备方法包括以下步骤：

4、(1)载体骨架的合成

5、称取适量的有机单体m1，交联剂m2，致孔剂p1，致孔剂p2，引发剂i1于容器中，搅拌均匀后，抽真空、充氮气交替进行3-5次，在氮气氛围下将此混合液倾倒入一端密封的管状模具中，待油相混合物完全转入后，封闭另外一端。将此管状容器置于55-90℃的水浴中聚合反应，反应6-18h后，将模具两端密封拆除，将此管通过管道与泵连接，将溶剂四氢呋喃、或甲苯、或dmf泵入含有聚合物整体的管子中以移走致孔剂和残留的单体，将此聚合物载体骨架从模具中移出，可得到圆柱状的聚合物载体柱床。

6、(2)功能化修饰

7、(i)将上述(1)中得到的聚合物载体骨架，用环氧树脂材料将柱床包裹，填充于内衬聚四氟乙烯的不锈钢色谱柱子中；称取适量的多聚甲醛、三甲基氯硅烷、催化剂四氯化锡于二氯甲烷中混合均匀；将此混合物通过泵与此不锈钢色谱柱管子相连，进行在线循环反应，反应结束后，用大量的溶剂清洗干净，得到氯甲基载体；

8、(i i)称取适量的单体a1与溶剂s1中，通过泵与(i)中色谱柱管子相连，继续进行在线循环反应；反应结束后，用甲醇或乙醇清洗，可得到含有氨基的载体。

9、进一步地，所述步骤(1)中的单体m1为苯乙烯、或乙基苯乙烯。

10、进一步地，所述步骤(1)中的交联剂m2为二乙烯基苯、或二甲基丙烯酸乙二醇酯。

11、进一步地，所述步骤(1)中的致孔剂p1为线性聚苯乙烯，分子量为1000-100000。

12、进一步地，所述步骤(1)中的致孔剂p2为甲苯、或正己醇、或庚烷、或环己醇、或异丁醇。

13、进一步地，所述步骤(1)中的引发剂i1为过氧化苯甲酰、或过偶氮二异丁腈、或偶氮二异丁基脒任意一种或者几种的混合物。

14、进一步地，所述步骤(1)中的管状容器可以选用不锈钢、或聚醚酮(peek)、或熔融石英管、或玻璃管。

15、进一步地，所述步骤(1)中的单体m1与m2质量比为10:90～1:99。

16、进一步地，所述步骤(1)中的i1与m1及m2质量总和的比为0.05:10～0.5:10。

17、进一步地，所述步骤(1)中的p1与p2的质量中和与m1及m2质量总和的比为：0.5:1～5:1。

18、进一步地，所述步骤(1)中的p1与p2的质量比为0.5:1～2:1。

19、进一步地，所述的聚合物载体柱床孔径为300nm-3μm。

20、进一步地，所述的步骤(2)中多聚甲醛、三甲基氯硅烷、催化剂四氯化锡的质量配比为10:6:20：2.5。

21、进一步地，所述的步骤(2)中的溶剂a1为乙二胺、或丁二胺、或己二胺。

22、进一步地，所述的步骤(2)中的溶剂s1为dmso、或dmf、或四氢呋喃。

23、与现有技术相比，本发明的显著优点是：

24、本发明首先合成一种新型的超大孔的载体，孔径大于500nm，且此孔是相互连通的贯穿孔，孔隙率高，且流速较快，解决了核酸合成过程中溶剂及单体的传质、极性等问题，提高了核酸合成效率，降低了生产成本高。

技术特征：

1.一种新型核酸固相合成载体的制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中的单体m1为苯乙烯、或乙基苯乙烯；所述交联剂m2为二乙烯基苯、或二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述致孔剂p1为线性聚苯乙烯，分子量为1000-100000；，所述步骤的致孔剂p2为甲苯、或正己醇、或庚烷、或环己醇、或异丁醇任意一种或者几种的混合物；所述的引发剂i1为过氧化苯甲酰、或过偶氮二异丁腈、或偶氮二异丁基脒任意一种或者几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中的单体m1与m2质量比为10:90～1:99；所述i1与m1及m2质量总和的比为0.05:10～0.5:10；所述步骤(1)中的p1与p2的质量中和与m1及m2质量总和的比为：0.5:1～5:1；所述步骤(1)中的p1与p2的质量比为0.5:1～2:1。

4.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中多聚甲醛、三甲基氯硅烷、催化剂四氯化锡的质量配比为10:6:20：2.5。

5.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中的所述步骤(1)中的管状容器可以选用不锈钢、或聚醚酮(peek)、或熔融石英管、或玻璃管。

6.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中的溶剂s1为dmso、或dmf、或四氢呋喃。

7.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中的单体s1为乙二胺、或丁二胺、或己二胺。

8.根据权利要求1所述的一种新型核酸固相合成载体的制备方法，其特征在于所述的聚合物载体柱床孔径为300nm-3μm。

技术总结
本发明公开了一种新型核酸固相合成载体的制备方法，该种新型核酸固相合成载体包括聚苯乙烯基骨架和功能性氨基基团；聚苯乙烯基骨架具有机械性能好、疏水性强优点，氨基基团便于与核酸固相合成的连接头间臂偶联。使用本发明合成的核酸固相合成载体孔径大于500nm，且此孔是相互连通的贯穿孔：具有孔隙率高，液体流速较快等优点，解决了核酸固相合成过程中溶剂及单体在常规载体中的传质慢问题，提高了核酸合成效率，降低了生产成本。

技术研发人员：请求不公布姓名,请求不公布姓名
受保护的技术使用者：南京亘闪生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/23