一种防止空间转录组实验过程中组织脱片的方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种防止空间转录组实验过程中组织脱片的方法。

背景技术：

1、空间转录组技术是基于冷冻切片技术对新鲜冷冻组织进行切片，并将组织切片放置在含有与rna结合捕获探针的载玻片上。通过固定、成像获取组织空间位置信息后建立单个反应池对组织切片进行透化使细胞中的mrna得到释放，并结合到相应的捕获探针上。以捕获的rna为模板进行cdna合成和测序文库制备，对制备好的文库进行测序，从而获取在组织空间维度上单个细胞的基因表达信息。

2、在空间转录组实验过程中，组织切片黏附于含有rna结合捕获探针的载玻片，使得细胞中透化下来mrna可以被捕获探针进行原位捕获。然而，组织与载玻片的黏附主要依靠静电吸附，这就导致不同组织对于载玻片的黏附度不同。若组织切片在透化及mrna捕获过程中脱片，则会严重影响基因表达信息的获取并影响后续基因数据的分析。目前冷冻切片防脱片主要有高温孵育同时增加组织干燥孵育时间及多聚赖氨酸包被载玻片这两种方法，组织长时间干燥及高温孵育会导致rna降解。多聚赖氨酸包被含有rna捕获探针的芯片会导致核糖体rna含量升高影响rna捕获。由于空间转录组对rna质量要求较高，还需要在不影响rna质量的情况下提供一种防脱片方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种防止空间转录组实验过程中组织脱片的方法，不影响rna质量及探针捕获的前提下有效防止组织脱片。

2、本发明提供一种组织切片防脱网，为60目-80目的防护网；所述防护网为钛丝网(优选为纯钛丝网)。添加本发明组织切片防脱网不影响空间转录组技术。通过实验证明，利用本发明的物理覆盖组织进行空间转录组实验可以有效防止组织脱片现象，且不影响后续透化及mrna捕获。

3、本发明提供防脱网的制备方法，包括将钛丝网清洗结束后置于0.08-0.12m盐酸中于35-39℃孵育0.8-2h；可以使试验效果更佳。

4、优选为将钛丝网清洗结束后置于0.09-0.11m盐酸中于36-38℃孵育0.8-1.2h。

5、根据所述组织切片防脱网的制备方法，将所述防脱网依次经酒精和超声清洗；

6、优选的，将防脱网放入97-99％浓盐酸中室温孵育2-5min，孵育结束后使用70％-80％酒精清洗2次。

7、所述超声清洗为：将防脱网放置在盛有超纯水的容器中，进行超声。

8、根据所述组织切片防脱网的制备方法，所述超声的功率为300-500w，优选为500w，超声频率25-45hz,所述超声的时间为8-12min。利用该超声参数，组织在进行空间转录组实验过程时的荧光信号强度及组织透化完整性更优。

9、根据所述组织切片防脱网的制备方法，将防脱网用75％酒精清洗2次，清洗后放入称有超纯水的ep管中，然后将ep管放入超声清洗机中超声清洗。

10、优选的，包括以下步骤：1、将钛丝网按照反应池胶垫大小进行裁剪

11、2、裁剪后将防脱网放入98％浓盐酸中室温孵育2-5min，孵育结束后使用70％-80％酒精清洗2次。

12、3、清洗结束后将防脱网放入0.1m盐酸中置于37℃孵育1-2h，孵育结束后使用70％-80％酒精清洗2次。

13、4、清洗后将防脱网放入盛有超纯水的管中置于超声清洗仪中，超声频率25-45hz，清洗8-12min。

14、5、清洗结束后取出，干燥储存。

15、本发明提供防脱网的使用流程，包括以下步骤：

16、1、使用rnazap清洗防脱网1次，70％-80％酒精清洗两次，再使用无核酸酶水清洗两次

17、2、清洗后将防脱网固定再反应池胶垫内侧边缘，保证防脱网与胶垫底面齐平。

18、3、将贴有组织的芯片放置于固定卡夹上，将卡夹、胶垫、芯片紧密固定在一起。

19、4、向反应池加入0.01％-0.1％吐温20，润洗防脱网与反应池

20、5、向反应池加入无核酸酶水，清洗2次。

21、6、清洗后开始其他实验流程。

22、优选的，在使用时，依次为胶垫、防脱网、贴有组织的芯片；

23、将胶垫、防脱网、贴有组织的芯片利用固定卡夹固定；

24、所述贴有组织的芯片上含有与rna结合的捕获探针。

25、本发明还提供一种反应池，包括可拆卸的所述组织切片防脱网。

26、根据所述反应池，将所述组织切片防脱网安装在反应池的胶垫上。

27、本发明还提供所述组织切片防脱网在空间转录组技术中的应用。

28、本发明还提供一种空间转录组测序的方法，将所述组织切片防脱网安装在反应池的胶垫上，然后安装贴有组织的芯片。

29、根据所述空间转录组测序的方法，反转录结束后取下防脱网。

30、使用前将用rnase zap清洗一次后使用75％酒精清洗2次后将防脱网安装在反应池的胶垫上，最后安装上空间转录组载玻片后可正常操作后续透化、反转录实验流程。反转录结束后打开卡夹，取下胶垫，移除防脱网后继续进行二链合成和cdna洗脱流程。

31、根据所述组织切片防脱网、所述组织切片防脱网的制备方法、所述反应池、或所述应用，所述组织包括所有类型组织，包括动物组织和植物组织。

32、本发明的有益效果：

33、本发明摈弃了原有化学包被及干燥等影响mrna质量及捕获的方法，采用本发明物理覆盖的方式可以较好的防止组织脱片，保证了空间转录组实验的顺利进行。

技术特征：

1.一种组织切片防脱网，其特征在于，为60目-80目的防护网；所述防护网为钛丝网。

2.权利要求1所述组织切片防脱网的制备方法，其特征在于，将钛丝网清洗结束后置于0.08-0.12m盐酸中于35-39℃孵育0.8-2h。

3.根据权利要求2所述组织切片防脱网的制备方法，其特征在于，将所述防脱网依次经酒精和超声清洗；

4.根据权利要求3所述组织切片防脱网的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为300-500w，优选为500w，超声频率25-45hz,所述超声的时间为8-12min。

5.一种反应池，其特征在于，包括可拆卸的权利要求1所述组织切片防脱网。

6.根据权利要求5所述反应池，其特征在于，将所述组织切片防脱网安装在反应池的胶垫上。

7.权利要求1所述组织切片防脱网在空间转录组技术中的应用。

8.一种空间转录组测序的方法，其特征在于，将权利要求1所述组织切片防脱网安装在反应池的胶垫上，然后安装贴有组织的芯片。

9.根据权利要求8所述空间转录组测序的方法，其特征在于，反转录结束后取下防脱网。

10.根据权利要求1所述组织切片防脱网、权利要求2-4任一项所述组织切片防脱网的制备方法、权利要求5或6所述反应池、或权利要求7所述应用，其特征在于，所述组织包括植物组织或动物组织。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种防止空间转录组实验过程中组织脱片的方法。本发明摈弃了原有化学包被及干燥等影响mRNA质量及捕获的方法，采用本发明物理覆盖的方式可以较好的防止组织脱片，保证了空间转录组实验的顺利进行。

技术研发人员：郑洪坤,张雪川,刘敏,毕经德,邓卫友,平丽莹
受保护的技术使用者：北京百迈客生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10