用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂、试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂、试剂盒。

背景技术：

1、百日咳是一种具有高度传染性的急性呼吸道疾病，主要是由百日咳鲍特菌(bordetella pertussis，简称bp)和副百日咳鲍特菌(b.parapertussis，简称bpp)引起。百日咳鲍特菌，也叫百日咳杆菌，是人类百日咳感染的主要致病菌，常常感染未接种疫苗的婴幼儿；副百日咳鲍特菌，也叫副百日咳杆菌，经常引起较轻微的百日咳样症状，并且持续时间比较短。世界卫生组织(world health organization，who)推荐的百日咳疑似病例临床诊断标(2018年9月)为咳嗽≥两周且至少伴有以下任意一种临床症状：阵发性咳嗽、吸气性吼声、咳嗽后或无其他明显原因造成的呕吐以及1岁以下婴儿呼吸暂停。尽管世界上绝大多数国家己经实施了百日咳疫苗的免疫接种，但据世界卫生组织统计报道，目前全世界每年仍有相当数量的百日咳患者，许多地方还出现了暴发性流行，即“百日咳再现(remeger)”。因为，一般百日咳疫苗对副百日咳鲍特菌几乎没有明显的保护作用，而副百日咳鲍特菌同样会引起典型的百日咳症状。

2、目前临床上用于百日咳杆菌检测最常用的方法有细菌培养法、血清学检测、分子生物学检测等。细菌培养法虽然特异性高，但敏感性较低，操作技术要求高，培养时间较长。免疫学检测虽然灵敏度和特异性较高，简单快速，但该法受病程、患者年龄及是否接种疫苗影响，此方法适合对百日咳杆菌感染后期的诊断及血清流行病学的研究，而对副百日咳鲍特菌及其他鲍特菌缺乏诊断价值。

3、以pcr为基础的分子诊断方法耗时短，敏感且特异，已经成为目前实验室诊断百日咳的最优方法，通过对百日咳及副百日咳保守区域分别设计特异性的引物和探针，对百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌分别进行快速检测，对于百日咳疾病的早期诊断及合理用药有很大的作用。目前国内已经有10家企业研制出百日咳杆菌核酸检测试剂，正处于注册或临床试验阶段，这些试剂大多是基于pcr-荧光探针法，个别是熔解曲线法。目前获得医疗器械注册证的试剂2个，均是以百日咳杆菌基因组保守序列为靶区域，设计特异性引物和荧光探针进行pcr扩增，其灵敏度分别为1.0×104copies/ml和400copies/ml，但均不能对副百日咳鲍特菌进行检测，容易对百日咳造成误诊或者漏诊。

4、cn113718045b通过序列多重比对，找出不同鲍特菌基因组的差异区域，经反复比对，确定bp2463基因的第2574316位至2576520位为最佳测序分型的靶标，利用上述区域作为靶标可以实现仅利用一个靶标即可准确地区分百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌。

5、随着百日咳患者的增加，临床表现的不典型化，且副百日咳鲍特菌和其他鲍特菌也会引起较轻微的百日咳样症状或相似症状，因此加强疑似病例的识别和实验室诊断是确诊和监测百日咳的重要保障，通过对百日咳杆菌和副百日咳杆菌的同时区分检测，可以进一步的减小临床上百日咳诊断的漏诊或误诊，对于百日咳疾病的早期诊断及合理用药有很大的作用。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂、试剂盒，以期解决上述的问题。

2、为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

3、本发明的第一方面保护用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂，包含第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组，其中，

4、所述第一引物探针组包含如seq id no.1和seq id no.2所示序列的第一引物对，以及如seq id no.3所示序列的第一探针；

5、所述第二引物探针组包含如seq id no.4和seq id no.5所示序列的第二引物对，以及如seq id no.6所示序列的第二探针；

6、所述第三引物探针组包含如seq id no.7和seq id no.8所示序列的第三引物对，以及如seq id no.9所示序列的第三探针。

7、本发明的第二方面保护用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂盒，所述试剂盒包含如前述所述的试剂。

8、本发明的第三方面保护如前述所述的试剂或如前述所述的试剂盒在制备百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌检测产品中的应用。

9、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

10、本发明的用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂、试剂盒能够对百日咳及副百日咳同时进行检测，且两者之间无干扰，相对于临床常用的细菌学与血清学方法其耗时短、敏感性高、特异性强，对于百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌引起的相关疾病的的诊断起到了很大的辅助作用。

技术特征：

1.用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂，其特征在于，包含第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组，其中，

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包含靶向内参基因rnase p的第四引物探针组。

3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述第四引物探针组包含seq id no.10和seq id no.11所示序列的第四引物对，以及如seq id no.12所示序列的第四探针。

4.如权利要求1-3任一项所述的试剂，其特征在于，所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5′端偶联荧光报告基团，3′端偶联荧光淬灭基团。

5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texas red和lc red640中的一种；

6.用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-5任一项所述的试剂。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品和pcr反应液中的一种或多种。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包含dna聚合酶、udg酶、dntps、mg2+和水中的一种或多种。

9.如权利要求1-5任一项所述的试剂或如权利要求6-8任一项所述的试剂盒在制备百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌检测产品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，利用如权利要求1-5任一项所述的试剂进行荧光pcr扩增，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了用于检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的试剂、试剂盒。所述试剂包含第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组。本发明还公开了包含前述所述试剂的试剂盒。本发明的试剂、试剂盒能同时对百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌进行分别检测，两者无干扰、耗时短、敏感性高、特异性强。

技术研发人员：刘燕,杜博博,邵俊斌
受保护的技术使用者：上海之江生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5