一种生殖支原体核酸检测试剂盒的制作方法

本发明涉及病原体检测，特别涉及一种生殖支原体核酸检测试剂盒。

背景技术：

1、生殖支原体(mycoplasrna genitalium,mg)属于柔膜体纲支原体目，是人类发现的第12种支原体。生殖支原体主要寄生于人体泌尿生殖道的上皮细胞，其粘附于宿主细胞表面，从细胞中吸取营养，释放对细胞有害的代谢产物，引起细胞膜的损伤，致使上皮细胞染色体异常，影响细胞的正常代谢，甚至导致细胞坏死。近年来研究人员对生殖支原体的致病性进行了深入的研究，证实了生殖支原体在生殖道疾病中的重要作用。研究表明，mg是引起非淋球菌尿道炎的主要病原体之一，可引起宫颈炎、盆腔炎、前列腺炎、附睾炎、关节炎、输卵管不孕等症状。故及早发现并有效治疗mg感染对于预防和控制生殖支原体传播至关重要。

2、目前用于生殖支原体检验的方法主要有三种，分别为病原培养法、血清学方法、分子生物学方法。分离培养mg病原体是最传统的检测方法，但是用培养方法鉴定mg所需时间过长(大于50天)，且mg营养条件苛刻，不易培养，因此难以应用于mg的临床诊断中。血清法检测mg抗体的诊断标准与时间难以掌握，在感染初期不易检出，灵敏度较低。而且mg与肺炎支原体血清学特性交叉广泛，特异性也无法保证。目前针对mg检测的分子生物学方法主要是荧光定量pcr法，其优点是操作简单、特异性强。但pcr法需要消耗昂贵的荧光探针以及配套价值不菲的检测仪器，检测成本高，对实验人员的操作技术要求也较高，而且易受多种限制因素的影响，如单一检测一种病原体，费时、费力、检测成本高，而同时检测多种病原体时pcr检测的效率不高；扩增产物dna污染可能导致检测结果假阳性，dna污染又非常稳定难以消除等等。

3、因此，继续寻找一种操作便捷、成本低廉的mg病原体诊断方法是必要的。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种生殖支原体核酸检测试剂盒，通过引入rna恒温扩增与金探针层析相结合的策略，实现对生殖支原体核酸的高效检测。该方法无需高端复杂的仪器设备，仅需普通实验室条件，甚至简单到只需恒温水浴即可完成。该方法不仅灵敏度高、特异性强，而且操作简便，易于普及推广。同时，由于扩增产物为rna分子，其天然降解速度快，不易造成环境污染，为生殖支原体核酸检测的广泛应用提供了可能。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种生殖支原体核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：

4、生殖支原体的扩增引物，包括：如seq id no.1所示的mg-f引物、如seq id no.2所示的mg-r引物；

5、内参基因的扩增引物，包括：如seq id no.3所示的内参-f引物、如seq id no.4所示的内参-r引物；

6、特异探针ces，核苷酸序列选自seq id no.5或seq id no.6中的至少一种；

7、特异探针les，核苷酸序列选自seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9中的至少一种；

8、内参特异探针ces，核苷酸序列选自seq id no.10或seq id no.11中的至少一种；

9、内参特异探针les，核苷酸序列选自seq id no.12、seq id no.13或seq id no.14中的至少一种；

10、c线显色探针，核苷酸序列如seq id no.15所示；

11、金探针，核苷酸序列如seq id no.16所示；且所述金探针5’端被巯基化修饰；

12、试纸条，所述试纸条包括底板、粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、nc膜和吸水纸，其中，所述nc膜上按层析方向依次设有3条检测线，分别为mg-t线、内参-n线和质控-c线，所述mg-t线处包被有核苷酸序列如seq id no.17所示的mg包被探针、所述内参-n线处包被有核苷酸序列如seq id no.18所示的内参包被探针、所述质控-c线处包被有核苷酸序列如seq id no.19所示的质控包被探针。

13、进一步地，所述试剂盒还包括扩增反应液：tris-hcl(ph 8.0)，mgcl2，kcl，dmso，dtt，dntps，ntps。

14、进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照品。

15、进一步地，所述试剂盒还包括细胞裂解液。

16、进一步地，所述试剂盒还包括rna恒温扩增体酶：逆转录酶、rnaseh、t7 rna聚合酶。

17、进一步地，所述mg-t线包被的mg包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量为2～3μl/cm。

18、进一步地，所述内参-n线处包被的参包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量为2～3μl/cm。

19、进一步地，所述质控-c线处包被的质控包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量：2～3μl/cm。

20、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

21、1、本发明通过rna恒温扩增技术，实现了在同一管内同时扩增mg和内参基因两种指标的能力。这一方法不仅提高了检测效率，还确保了扩增产物的稳定性和可靠性。rna恒温扩增在42℃的环境中进行，使得实验仪器简化至恒温水浴锅，极大地降低了对实验设备的要求，提高了实验的可行性和普及性。此外，在设计扩增引物的同时经过多轮测试和验证，保证各单项引物均有较高的扩增效率且彼此之间不存在干扰。

22、2、本发明的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，特异性强，灵敏度高：

23、本发明中，经过精心设计的特异探针ces和les系列，在检测过程中起到了关键作用。它们通过分子桥的作用，成功地将包被探针、扩增产物rna以及金探针串联结合，实现了对指标rna核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的设计，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不会被成功的固定在nc膜上，也就不会出现阳性检测结果，确保了检测的特异性。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。

24、3、本发明融合了rna恒温扩增技术和试纸条层析技术的优势，既保留了rna恒温扩增对仪器要求低的优点，又发挥了胶体金快速检测的优势。试纸条检测核酸的结果只需5分钟左右即可判读，操作简便，对实验人员的技术要求低，无需特殊仪器设备，非常适合在基层和偏远农村医疗机构推广使用。

技术特征：

1.一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

2.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增反应液：tris-hcl(ph 8.0)，mgcl2，kcl，dmso，dtt，dntps、ntps。

3.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解液。

4.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品：阴性质控物为生理盐水。

5.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括rna恒温扩增酶：逆转录酶、rnaseh、t7 rna聚合酶。

6.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述mg-t线包被的mg包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量为2～3μl/cm。

7.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述内参-n线处包被的参包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量为2～3μl/cm。

8.根据权利要求1所述的一种生殖支原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述质控-c线处包被的质控包被探针的浓度为10±2μm，喷膜量：2～3μl/cm。

技术总结
本发明公开了一种生殖支原体核酸检测试剂盒，包括：生殖支原体的扩增引物、内参基因的扩增引物、特异探针CES、特异探针LES、内参特异探针CES、内参特异探针LES、C线显色探针、金探针和试纸条。本发明采用恒温扩增病原体RNA，并结合金探针层析的方法，检测生殖支原体核酸具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于生殖支原体核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

技术研发人员：李先强,姜昕,陈巨,周向珍,黄永伟,王琳琳,王博
受保护的技术使用者：武汉中帜生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/5