泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法与流程

本发明属于d-泛酸合成的，尤其涉及一种泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法。

背景技术：

1、泛酸（pantothenic acid）又名维生素b5、遍多酸，是辅酶a(coa)和酰基载体蛋白(acp)的组成部分；其主要具有参与体内能量制造、帮助细胞形成、脂肪和糖类转化、抗体的合成和维持肾上腺正常机能等作用，是生物体正常生长必须的营养物质之一。

2、其中，天然泛酸（d-泛酸）具有右旋光性，是一种重要的食品添加剂和饲料添加剂，也是一种重要的维生素药物，在临床上被用于治疗维生素b缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉素中毒及类风湿等疾病。d-泛酸生物合成途径包括泛解酸的合成、β-丙氨酸的合成以及泛解酸和β-丙氨酸在泛酸合成酶（panc）作用下的缩合而成的，生物合成途径主要包括泛解酸生物合成途径和β-丙氨酸生物合成途径。因此，加强有利于产物合成途径中关键基因的表达是菌株改造的重要思路之一。

3、现阶段，随着全基因组测序以及基因工程注释的完成，通过基因工程手段对微生物进行代谢工程改造，构建d-泛酸生产菌的方法越来越受到人们的重视。cn106676051a中采用高效的大肠杆菌蛋白表达系统，异源表达多种不同来源的泛酸合成酶（panc），获得高活性的泛酸合成酶菌株，该工程菌发酵38h，产泛酸101.2g/l。cn109868254a通过强化d-泛酸生物生成途径中关键酶panb、panc、pane和ilvc的表达，修复ilvg基因削弱反馈调控和强化泛解酸合成途径，敲除avta和敲降ilve对竞争支路进行削弱得到一株无质粒高产菌，d-泛酸效价从0.48g/l提高到1.54g/l。然而，所得d-泛酸生产菌中泛酸合成酶的活性低，不利于泛酸的高效合成，仍具有较大的局限性。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有的d-泛酸生产菌中泛酸合成酶活性低的缺陷，实现泛酸的高效合成，提供了一种泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法。

2、第一方面，本发明提供的泛酸合成酶突变体为包含t29k突变和/或l135p突变的原始泛酸合成酶，所述原始泛酸合成酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段。

3、在一些具体的实施方式中，所述泛酸合成酶突变体包括t29k突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:2所示的氨基酸片段。

4、在一些具体的实施方式中，所述泛酸合成酶突变体包括t135k突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:3所示的氨基酸片段。

5、在一些具体的实施方式中，所述泛酸合成酶突变体包括t29k突变和l135p突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:4所示的氨基酸片段。

6、第二方面，本发明提供一种构建体，所述构建体包括编码以上泛酸合成酶突变体的核苷酸片段。

7、在一些具体的实施方式中，所述构建体包括序列如seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7所示核苷酸片段中的一段或多段。

8、第三方面，本发明提供一种泛酸生产菌株，所述泛酸生产菌株能够表达以上泛酸合成酶突变体。

9、第四方面，本发明提供本发明第二方面所述的构建体的构建方法，所述构建方法包括将编码海生丙酸菌（ propionigenium maris）原始泛酸合成酶的基因重组至质粒载体得到原始质粒，将所得原始质粒采用突变引物进行定点突变，即得到构建体。

10、在一些具体的实施方式中，所述突变引物包括t29k突变引物和/或l135p突变引物；所述t29k突变引物包括核苷酸序列如seq id no:8所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:9所示的反向引物；所述l135p突变引物包括核苷酸序列如seq id no:10所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:11所示的反向引物。

11、第五方面，本发明提供一种泛酸合成酶突变体的制备方法，所述制备方法包括采用以上构建体转化宿主细胞，得到泛酸生产菌株；采用泛酸生产菌株表达泛酸合成酶突变体。

12、在一些具体的实施方式中，所述宿主细胞选自大肠杆菌fv5069、大肠杆菌fv5069/pfv31或大肠杆菌mg1655中的一种或多种。

13、在一些具体的实施方式中，所述构建体包含于ptrc-cyca质粒载体上。

14、第六方面，本发明提供了以上泛酸合成酶突变体和/或泛酸生产菌株在发酵培养合成d-泛酸中的应用。

15、第七方面，本发明提供的一种泛酸的制备方法，该方法包括：将β-丙氨酸在上述泛酸合成酶突变体和/或泛酸生产菌株的存在下进行发酵，得到泛酸。

16、有益效果：

17、本发明通过在原始泛酸合成酶中引入t29k和/或l135p突变，所获得的泛酸合成酶突变体相较于原始泛酸合成酶，酶催化活性得到了明显增强，将该泛酸合成酶突变体应用于泛酸发酵菌株的构建中，可增强菌株合成表达d-泛酸的能力，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种泛酸合成酶突变体，其特征在于，所述泛酸合成酶突变体为包含t29k突变和/或l135p突变的原始泛酸合成酶，所述原始泛酸合成酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段。

2.根据权利要求1所述的泛酸合成酶突变体，其特征在于，所述泛酸合成酶突变体包括t29k突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:2所示的氨基酸片段。

3.根据权利要求1所述的泛酸合成酶突变体，其特征在于，所述泛酸合成酶突变体包括t135k突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:3所示的氨基酸片段。

4.根据权利要求1所述的泛酸合成酶突变体，其特征在于，所述泛酸合成酶突变体包括t29k突变和l135p突变，所述泛酸合成酶突变体包括序列如seq id no:4所示的氨基酸片段。

5.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括编码权利要求1~4任一所述泛酸合成酶突变体的核苷酸片段。

6.根据权利要求5所述的构建体，其特征在于，所述构建体包括序列如seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7所示核苷酸片段中的一段或多段。

7.一种泛酸生产菌株，其特征在于，所述泛酸生产菌株能够表达权利要求1~4任一所述的泛酸合成酶突变体。

8.权利要求5或6所述构建体的构建方法，其特征在于，该方法包括将编码海生丙酸菌（propionigenium maris）原始泛酸合成酶的基因片段重组至质粒载体得到原始质粒，将所得原始质粒采用突变引物进行定点突变，即得到构建体。

9.根据权利要求8所述的构建体的构建方法，其特征在于，所述突变引物包括t29k突变引物和/或l135p突变引物；所述t29k突变引物包括核苷酸序列如seq id no:8所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:9所示的反向引物；所述l135p突变引物包括核苷酸序列如seq id no:10所示的正向引物和/或核苷酸序列如seq id no:11所示的反向引物。

10.一种泛酸合成酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括采用权利要求5或6所述的构建体转化至宿主细胞，得到泛酸生产菌株；采用泛酸生产菌株表达泛酸合成酶突变体。

11.根据权利要求10所述的泛酸合成酶突变体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌fv5069、大肠杆菌fv5069/pfv31或大肠杆菌mg1655中的一种或多种。

12.权利要求1~4任一所述的泛酸合成酶突变体和/或权利要求7所述的泛酸生产菌株在发酵培养合成d-泛酸中的应用。

13.一种泛酸的制备方法，其特征在于，该方法包括：将β-丙氨酸在权利要求1~4任一所述的泛酸合成酶突变体和/或权利要求7所述的泛酸生产菌株的存在下进行发酵，得到泛酸。

技术总结
本发明属于D‑泛酸合成的技术领域，公开了一种泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法。所述泛酸合成酶突变体为包含T29K突变和/或L135P突变的原始泛酸合成酶，所述原始泛酸合成酶包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段和/或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80%同源性的变体序列。本发明提供的泛酸合成酶突变体与原始泛酸合成酶相比，其酶活得到明显增强，将其应用于泛酸发酵菌株的构建当中，可以增强菌株代谢合成泛酸的能力，具有良好的应用前景。

技术研发人员：钟锦潮,马立清,陈必钦,张璐,赵珍,朱志春,祝俊,李丹
受保护的技术使用者：内蒙古金达威药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6