条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒

本发明涉及分子生物学，具体说是一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、检测方法、引物和试剂盒。

背景技术：

1、我国近年来在条石鲷的人工繁殖、苗种养殖等方面取得了长足进步。现养殖年产值可达5000多万元，苗种年产增加到100多万尾。此外，它作为混养对象还可降低其他水产养殖的成本。据研究条石鲷采用性别决定机制为x1x1x2x2/x1x2y。雄鱼生长速度更快是因为带有y染色体。未来如果能研发快速鉴定鱼苗性别的技术，有助于选育生长更快的雄性品种，从而提高养殖效率和产值，更好地开发利用这一重要渔业资源。

2、ndc80 着丝粒复合体成分（ndc80 kinetochore complex component，ndc80），也称为 hec1，在细胞分裂和染色体分离中起着至关重要的作用。ndc80基因编码的蛋白质是ndc80 复合体的一部分，该复合体对于细胞分裂过程中染色体正确附着到有丝分裂纺锤体至关重要。如果没有这种附着，染色体就无法正确分离到子细胞中，从而导致潜在的遗传异常和细胞死亡。对 ndc80 基因的研究表明其在维持基因组稳定性和预防癌症等疾病方面的重要性。该基因的突变与染色体不稳定和非整倍性有关，这两者都是癌细胞的共同特征。了解 ndc80 基因的功能及其在细胞分裂中的作用可能为癌症发展和潜在治疗靶点提供有价值的见解。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服了现有条石鲷ndc80基因内含子dna插入变异检测技术不足，提供了一种检测条石鲷遗传性别分子标记、引物对、检测方法、试剂盒及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记，以条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入作为条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记。

4、所述分子标记为条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入的特异性标记的核苷酸序列；其中，核苷酸序列为seq id no:1（chrx1ndc80）和seq id no:2（chryndc80）所示碱基。

5、所述条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入的特异性标记中seq id no:1所示碱基为条石鲷雌、雄鱼x1染色体共有ndc80基因内含子区未发生dna插入的同源片段；其为条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入个体共有dna特征标记；且，所述seq id no:1所示碱基序列第66位点和67位点之间、第99位点和100位点之间插入序列片段，即为seqid no:2所示碱基序列，其为条石鲷ndc80基因内含子区变异特有的dna标记。

6、一种所述的检测条石鲷遗传性别的分子标记的应用，所述分子标记在检测条石鲷遗传性别中的应用。

7、一种鉴定所述的条石鲷遗传性别的分子标记的方法，

8、1）pcr扩增：取待测条石鲷，提取基因组dna；以所得基因组dna为模板，采用条石鲷分子标记的特异性引物对，进行pcr扩增，并将所得pcr扩增产物与所述的特异性标记进行对比；

9、2） 结果判断：从待测条石鲷的基因组dna中扩增出208bp（seq id no:1所示碱基）和749bp（seq id no:2所示碱基）两个dna片段，即为判断该待测条石鲷为ndc80基因内含子区发生dna插入变异个体，即为条石鲷雄性（x1x2y）个体；

10、3）待测条石鲷的基因组dna中仅扩增出208bp（seq id no:1所示碱基）的单一dna片段，即为判断该待测条石鲷为条石鲷ndc80基因内含子区未发生dna插入个体，即为条石鲷雌性（x1x1x2x2）个体。

11、所述的所述分子标记鉴定条石鲷雌雄的方法，所述引物为

12、chndc80_f:1 : 5’-aagtgaagaaagttcatgatggc-3’；

13、chndc80_r:2 : 5’-tctgccaatgtgcttggtctacg -3’。

14、所述的条石鲷雌雄遗传性别的特异性标记的遗传性别特异性引物，

15、chndc80_f:1 : 5’-aagtgaagaaagttcatgatggc-3’；

16、chndc80_r:2 : 5’-tctgccaatgtgcttggtctacg -3’。

17、一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的遗传性别特异性引物。

18、本发明所具有的优点：

19、本发明通过条石鲷雄鱼融合染色体y上的ndc80基因与位于雌鱼同源染色体x上的ndc80基因相比较发生了大片段的内含子序列插入，进而高效、快速精准鉴定条石鲷ndc80基因内含子是否发生dna插入变异，对于揭示条石鲷的雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体配对及分离规律，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升条石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。

20、本发明从条石鲷全基因组序列中筛选并获得了条石鲷x和y染色体ndc80基因内含子同源区段且有大片段dna插入标记序列，进一步建立了条石鲷ndc80基因内含子dna插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷ndc80基因内含子是否发生dna插入。该方法利用一对引物在ndc80基因内含子dna插入个体中扩增出749bp和208bp两个相差541bp的条带，在ndc80基因内含子为发生dna插入个体中仅扩增出208bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了条石鲷ndc80基因内含子变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在条石鲷基于ndc80基因雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体分离研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。

技术特征：

1.一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记，其特征在于：以条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入作为条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述分子标记为条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入的特异性标记的核苷酸序列；其中，核苷酸序列为seq id no:1（chrx1ndc80）和seq id no:2（chry ndc80）所示碱基。

3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于：所述条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入的特异性标记中seq id no:1所示碱基为条石鲷雌、雄鱼x1染色体共有ndc80基因内含子区未发生dna插入的同源片段；其为条石鲷ndc80基因内含子区dna插入与非插入个体共有dna特征标记；且，所述seq id no:1所示碱基序列第66位点和67位点之间、第99位点和100位点之间插入序列片段，即为seq id no:2所示碱基序列，其为条石鲷ndc80基因内含子区变异特有的dna标记。

4.一种利用权利要求1所述分子标记鉴定条石鲷雌雄的方法，其特征在于，

5.根据权利要求4所述的所述分子标记鉴定条石鲷雌雄的方法，其特征在于，所述特异性引物

6.一种检测权利要求1所述的条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记的引物，其特征在于：

7.一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含权利要求6所述的遗传性别特异性引物。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，具体说是一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒。以条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入作为条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记。并且，进一步建立条石鲷ndc80基因内含子区变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷ndc80基因内含子是否发生DNA片段插入变异。该方法在条石鲷基于ndc80基因雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体配对及分离研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。

技术研发人员：肖永双,肖志忠,李军,赵海霞,马玉婷,吴燕铎,陈少华,徐平蕊
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8