一种工程化牛奶外泌体的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物，涉及一种工程化外泌体，具体涉及一种工程化牛奶外泌体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、牛奶外泌体作为牛奶中天然存在的一种成分，研究人员已经对其进行了很多研究。其中，牛奶外泌体在2020年之后被报道在美容领域的应用潜力，例如据报道牛奶外泌体包裹的mir-2478可以通过与rap1a特异性结合，通过gsk-3β途径，抑制黑色素生成中的关键基因mitf的表达，从而降低黑色素生成，达到提亮肤色的作用，另外，次年牛奶外泌体被报道在小鼠毛囊生成及毛发再生中的调控作用，这些均为牛奶外泌体在美容健康领域的应用提供了理论基础。

2、但是在临床应用中发现，牛奶外泌体美白的效果却是微乎其微，究其原因是，牛奶外泌体在作用于皮肤之后，会被除黑色素细胞之外的其他非特异性细胞摄取，降低其发挥功效的效率。如何靶向的使牛奶外泌体由黑色素细胞摄取，增强其美白的功效，是当下亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种工程化牛奶外泌体的制备方法。

2、本发明的第二目的是提供一种工程化牛奶外泌体在药品和妆品方面的应用。

3、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

4、一种工程化牛奶外泌体的制备方法，包含牛奶外泌体的提取，胆固醇-九肽的合成，靶向牛奶外泌体的修饰工艺，主要步骤如下：

5、s1：牛奶外泌体的提取

6、本发明对牛奶外泌体的提取方法不做特别限定，示例性地，牛奶外泌体的制备方法如下：

7、a.乳清收集：取新鲜牛奶，高速冷冻离心机在2-8℃下，2000-3000g离心20min，脂肪层与乳清分离，收集乳清；

8、b.上清液收集：在上述乳清中加入等体积超纯水，边搅拌使用6n盐酸调节ph至4.58-4.62，然后在高速冷冻离心机中，2-8℃下，10000-12000g离心40-60min，离心后收集上清液；

9、c.牛奶外泌体收集：将上述上清液在2-8℃下，100000-150000g离心60-90min，取沉淀得到牛奶外泌体。

10、s2：胆固醇-九肽的合成

11、i.胆固醇丁二酸单酯合成处理：精密称取胆固醇1g和丁二酸酐0.388g,溶于5ml吡啶中，待全部溶解后计时反应72h，反应完成后加入1m稀盐酸1ml,45ml的饱和食盐水，待产物析出后过滤洗涤数次，冻干即得胆固醇丁二酸单酯；

12、ii.胆固醇-九肽合成：称取胆固醇丁二酸单酯100mg、dmtmm[4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐]缩合剂114mg溶于dmso中，搅拌活化半小时后，加入496mg九肽-1，45℃水浴搅拌反应24h，加超纯水透析三天后经真空冷冻冻干即得所述胆固醇-九肽。

13、s3：靶向牛奶外泌体的修饰

14、i.胆固醇-九肽处理：将1mg胆固醇-九肽加入到200μl无水乙醇中，经超声溶解后再向其中加入800μl pbs缓冲液，涡旋震荡混匀得到胆固醇-九肽溶液；

15、ii.胆固醇-九肽的装载：吸取1μl胆固醇-九肽溶液加入到999μl牛奶外泌体溶液中，再将9.5mg pbs冻干粉加入其中，超声孵育10min即得到靶向牛奶外泌体溶液。

16、一种工程化牛奶外泌体在改善黑色素沉淀药物中的应用。

17、所述药物为外用型。

18、一种工程化牛奶外泌体在制备美白化妆品方面的应用。

19、所述化妆品可以为水剂或乳剂。

20、所述化妆品可以为面霜。

21、所述化妆品可以为面膜。

22、本发明的有益效果为：

23、1)本发明在牛奶外泌体表面修饰了胆固醇-九肽配体，其中九肽-1可以特异性识别黑色素细胞上的mc1r受体，因此增强了单独牛奶外泌体的靶向性，降低其被非特异性细胞摄取的几率。

24、2)本发明中合成的胆固醇-九肽，主要是给九肽-1连接一个脂溶性的成分，让其可以连接到外泌体表面的磷脂双分子层中，而胆固醇又是外泌体膜和细胞膜的重要组成成分，该成分的存在也可以增强磷脂双分子层的稳固性，因此胆固醇-九肽的修饰也可以增强牛奶外泌体本身的稳定性。

25、3)本发明中的靶向牛奶外泌体中，牛奶外泌体可以通过抑制tyr/mitf基因从而抑制酪氨酸酶活性，降低黑色素表达量；在牛奶外泌体表明修饰的九肽-1一方面作为牛奶外泌体的靶向配体，另一方面九肽-1通过竞争性拮抗α-msh也可以达到美白的功效。将这两者结合后可以达到不同通道的双重美白效果。

26、4)本发明提供的工程化牛奶外泌体的制备方法，具有产量高，低毒性，成本低，操作简单等优势，所述工程化牛奶外泌体具备成为外用药物和化妆品新原料的应用潜能。

技术特征：

1.一种工程化牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种工程化牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，所述s1：牛奶外泌体的提取，具体步骤为：

3.根据权利要求1所述的一种工程化牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，所述s2：胆固醇-九肽的合成，具体步骤为：

4.根据权利要求1所述的一种工程化牛奶外泌体的制备方法，其特征在于，所述s3：靶向牛奶外泌体的修饰，具体步骤为：

5.一种工程化牛奶外泌体在改善黑色素沉淀药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述药物为外用型。

7.一种工程化牛奶外泌体在制备美白化妆品方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为水剂或乳剂。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为面霜。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品可以为面膜。

技术总结
本发明公开了一种工程化牛奶外泌体的制备方法及其应用。在牛奶外泌体表面修饰了胆固醇‑九肽配体，其中九肽‑1可以特异性识别黑色素细胞上的MC1R受体，因此增强了单独牛奶外泌体的靶向性，降低其被非特异性细胞摄取的几率。另一方面九肽‑1通过竞争性拮抗α‑MSH也可以达到美白的功效，将九肽‑1与牛奶外泌体结合后，具有双通道的美白效果。本发明提供的工程化牛奶外泌体的制备方法，具有产量高，低毒性，成本低，操作简单等优势，所述工程化牛奶外泌体具有成为外用药物新原料和化妆品新原料的应用潜能。

技术研发人员：李雪茹,吴欣昌,张琪,任春娟
受保护的技术使用者：陕西微泌生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/15