一种具有提高免疫力的板蓝根精制多糖及其脱除蛋白纯化方法及其应用

本发明属于生物医药领域，主要涉及一种板蓝根多糖脱蛋白方法及其应用。

背景技术：

1、中药多糖因其资源丰富、来源天然、生物活性好、毒副作用小等优势成为近年来天然药物的研究热点。研究发现中药多糖具有免疫调节作用，临床用作免疫调节剂，如香菇多糖具有显著的抗肿瘤活性，在临床上被用作抗肿瘤的佐剂，配合放化疗药物使用可以起到增强机体免疫力、减轻不良反应的作用。板蓝根为十字花科植物菘蓝isatis indigoticafort.的干燥根，首载于汉代的《神农本草》，在中国已拥有数千年的用药历史。其性苦，寒。归心、胃经，具有清热解毒，凉血利咽的功效。板蓝根多糖是板蓝根的主要活性成分之一，研究发现板蓝根多糖可以降炎症因子的分泌，双向调节tlrs受体的表达而发挥双向免疫调节作用。板蓝根多糖作为疫苗佐剂，可以提高淋巴细胞的增殖，弥补dna疫苗的免疫原性缺陷调节免疫方向偏于细胞免疫，发挥以细胞免疫为主导的th1型和th2型混合免疫作用。

2、然而，未经纯化的板蓝根多糖中含有大量的非多糖杂质，难以实现质量控制，干扰其结构分析和生物活性研究，甚至影响其生物活性的发挥，因此对多糖进行脱蛋白处理是探究多糖结构及生物活性中重要内容。常用的脱蛋白方法有sevage法、三氯乙酸法和大孔树脂分离法等，但上述方法存在操作过程繁琐、脱蛋白效率低、有机溶剂用量大且不易去除等缺点，而酶法具有不破坏多糖原有结构、脱蛋白效率高、经济环保等优点。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的在于提供一种板蓝根多糖脱蛋白纯化工艺，本发明所述的纯化工艺可以有效去除蛋白，不影响板蓝根多糖的结构。本发明的另一目的是提板蓝根多糖的制备方法和应用。

2、技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

3、一种具有提高免疫力的板蓝根精制多糖，它包括摩尔比为2.17﹕0.96﹕2.90﹕83.25﹕4.88﹕5.84的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。该板蓝根多糖分子量范围为5.82～60.26kda。

4、具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，它包括以下步骤：

5、s1：板蓝根多糖提取液制备；

6、s2：加入蛋白酶酶解；

7、s3：反复冻融，冷冻干燥。

8、作为优选方案，以上所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，它包括以下步骤：

9、(1)步骤s1热水回流法制备板蓝根多糖过程为：取板蓝根饮片，加入去离子水浸泡，回流提取，过滤，滤渣再加去离子水第二次回流提取，过滤后合并两次水煎液；离心去除沉淀，上清液即为板蓝根多糖提取液；

10、(2)步骤s2酶解过程为：取适量板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶进行酶解，然后置于沸水浴中灭活，冷却至室温，离心，去除加入的蛋白酶；

11、(3)取步骤(2)所述酶解板蓝根多糖水煎液，浓缩至适量浓度，加入乙醇，静置过夜收集沉淀；将沉淀挥发至无醇味，加水复溶；将复溶于水的板蓝根多糖反复冻融，离心除去析出的絮状杂质，浓缩后真空干燥即得纯化板蓝根多糖命名为irps-te。

12、作为优选方案，以上所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，它包括以下步骤：

13、(1)步骤s1热水回流法制备板蓝根多糖过程为：取板蓝根饮片，加入8～10倍量去离子水浸泡0.5～1h，回流提取2～3h，过滤，滤渣再加去离子水回流提取1～2h，过滤后合并两次水煎液；4000r·min-1离心10～20min去除沉淀，上清液即为板蓝根多糖提取液；

14、(2)步骤s2酶解过程为：取适量板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶进行酶解，然后置于沸水浴中灭活，冷却至室温，4000r·min-1离心20～30min，去除加入的蛋白酶；

15、(3)取步骤(2)所述酶解板蓝根多糖水煎液，浓缩至适量浓度，加入95％乙醇使醇含量为70-80％，静置过夜收集沉淀；将沉淀挥发至无醇味，加水复溶；将复溶于水的板蓝根多糖反复冻融2～3次，每次以4000r·min-1离心20～30min除去析出的絮状杂质，浓缩后真空干燥即得纯化板蓝根多糖命名为irps-te。

16、作为更加优选方案，以上所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，它包括以下步骤：

17、(1)步骤s1热水回流法制备板蓝根多糖过程为：取板蓝根饮片200g，加入8倍量去离子水浸泡1h，回流提取3h，过滤，滤渣与去离子水质量体积比例为1：4g·ml-1第二次回流1h，过滤后合并两次水煎液；4000r·min-1离心10min去除沉淀，上清液即为板蓝根多糖提取液；

18、(2)步骤s2酶解过程为：取适量板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶进行酶解，然后置于沸水浴中灭活20min，冷却至室温，4000r·min-1离心20min，去除加入的蛋白酶；

19、(3)取步骤(2)所述酶解板蓝根多糖水煎液，浓缩至适量浓度，加入95％乙醇使醇含量为70～80％，静置过夜收集沉淀；将沉淀50℃挥发至无醇味，加水复溶；将复溶于水的板蓝根多糖反复冻融2～3次，每次以4000r·min-1离心除去析出的絮状杂质，浓缩后真空干燥即得纯化板蓝根多糖命名为irps-te。

20、作为优选方案，以上所述的板蓝根多糖提取液酶法脱蛋白方法为：取适量板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶使酶活为490～500u·ml-1、ph 8.0～8.2、酶解时间3～6h、酶解温度35～37℃，然后置于沸水浴中灭活20～30min，冷却至室温，4000～5000r·min-1离心20～30min，去除加入的蛋白酶。

21、作为更加优选方案，以上所述的板蓝根多糖提取液酶法脱蛋白方法为：取适量板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶使酶活为500u·ml-1、ph 8.0、酶解时间5h、酶解温度37℃，然后置于沸水浴中灭活20min，冷却至室温，4000r·min-1离心20min，去除加入的蛋白酶。

22、作为优选方案，以上所述的板蓝根多糖醇沉及反复冻融方法为：取酶解板蓝根多糖水煎液，浓缩至适量浓度，加入95％乙醇使醇含量为70～80％，静置过夜收集沉淀。

23、有益效果：

24、本发明通过大量实验响应面优化酶法脱蛋白工艺筛选出最佳的板蓝根多糖酶解脱蛋白的方法，得到的精制多糖纯度高，并通过板蓝根多糖结构分析其单糖组成摩尔比为2.17﹕0.96﹕2.90﹕83.25﹕4.88﹕5.84的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，并测定其相对分子质量分布在5.82～60.26kda。

25、本发明提供的纯化板蓝根精制多糖能显著增加斑马鱼免疫细胞密度，增加巨噬细胞增殖，降低免疫低下斑马鱼体内il-1β和il-6含量，发挥免疫调节作用，可用于免疫增强类药品或保健品。

技术特征：

1.一种具有提高免疫力的板蓝根精制多糖，其特征在于，它包括摩尔比为2.17﹕0.96﹕2.90﹕83.25﹕4.88﹕5.84的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。

2.权利要求1所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

6.根据权利要求4或5所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)的酶解条件为酶活力为490～500u·ml-1、ph值为8.0～8.2、酶解时间3～6h、酶解温度35～37℃。

7.根据权利要求6所述的具有提高免疫力的板蓝根精制多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)的酶解条件为酶活力为500u·ml-1、ph值为8.0、酶解时间5h、酶解温度37℃。

8.权利要求1所述的板蓝根多糖在制备提高免疫力的保健品或药品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种具有提高免疫力的板蓝根精制多糖及其制备方法，它包括摩尔比为2.17﹕0.96﹕2.90﹕83.25﹕4.88﹕5.84的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。本发明通过水提板蓝根多糖提取液，加入胰蛋白酶将蛋白质分子酶解后，反复冻融，将蛋白质和胰蛋白酶一起除去。通过胰蛋白酶‑反复冻融联合法有效去除了板蓝根提取液中的蛋白质类杂质，并且不影响板蓝根多糖的结构。本发明提供的纯化板蓝根多糖能显著增加斑马鱼免疫细胞密度，增加巨噬细胞增殖，降低免疫低下斑马鱼体内IL‑1β和IL‑6含量，发挥免疫调节作用，可用于免疫增强类药品或保健品。

技术研发人员：肖平,宿树兰,赖梦亭,李彤,段金廒
受保护的技术使用者：南京中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/6/26