一种BsaI限制性内切酶的制备方法与流程

本发明属于分子生物学，具体涉及一种bsai限制性内切酶的制备方法。

背景技术：

1、bsai是一种iis型限制性内切酶，识别dna双链中的ggtctc序列，并切割位于识别序列后间隔1个碱基的4个任意碱基。与常见的tpyeii型限制性内切酶不同，bsai的识别位点和切割位置不位于同一处，因此常用于构建具有特定dna切割形状的片段，在分子克隆领域具有广泛应用。

2、目前，bsai限制性内切酶主要通过在大肠杆菌中表达获得，然而由于bsai对宿主dna会造成切割损伤，因此其表达难度较大。现有技术中，通过使用m.bsai(cn111019922 a)甲基化保护宿主来构建突变型限制性内切酶bsai，但该方法需要多个步骤进行筛选和试验，操作繁琐，且成本较高，限制了其在合成生物学等领域的大规模应用。此外，单一种类的甲基化只能保护单链，双链dna依旧会造成切割损伤，因此大肠杆菌表达bsai的难点在于宿主的位点特异性甲基化程度，位点特异性甲基化程度取决于m1.bsai与m2.bsai的表达水平与酶活力，然而调控m1.bsai与m2.bsai的难度较大。

3、因此，降低bsai限制性内切酶的生产难度，简化制备流程，对于bsai限制性内切酶的大规模应用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中bsai限制性内切酶生产难度大、成本高的问题，提供了一种简便、高效的bsai限制性内切酶的制备方法，降低了生产成本，提高了产量，有利于推动bsai限制性内切酶的广泛应用。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种bsai限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)构建r.bsai基因克隆质粒pet-bsair，将m.bsmai基因克隆至pet-bsair获得pet-bsmaim-bsair质粒；

5、(2)将阿拉伯糖操纵子基因克隆至pet-bsmaim-bsair，获得重组表达质粒pet-bsmaim-arabsair；

6、(3)将重组表达质粒pet-bsmaim-arabsair转入大肠杆菌top10菌株的感受态细胞中，筛选获得具备表达bsai限制性内切酶的重组表达菌株，诱导培养，纯化回收产物即为限制性内切酶bsai。

7、bsmai识别位点是gtctc，bsai酶识别位点是ggtctc，bsmbi酶识别位点是cgtctc，因此本发明构建含有甲基转移酶m.bsmai的重组表达质粒可以同时保护bsai，bsmbi，bsmai酶识别位点，继而获得表达bsai，bsmbi，bsmai酶的能力。

8、进一步地，步骤(1)中的r.bsai基因克隆质粒pet-bsair的构建方法包括以下步骤：从pet质粒载体中去除t7启动子序列，将sphi-ndei处进行置换，置换序列如seq id no:6所示，将置换序列与r.bsai基因序列融合，选择酶切位点为5’sphi-3’xhoi，通过基因重组方式构建入所述pet质粒载体中。

9、进一步地，所述大肠杆菌top10菌株的基因型为δ(mrr-hsdrms-mcrbc)或enda1。

10、mrr基因型具有切割甲基化dna(cmag/gmac)的能力，因此gag m6acc中的g m6ac会被切割。

11、因为最终产物是核酸酶，最下游应用时以dna作为底物进行特异性切割，因此enda1基因型可以避免最终产物中含有非特异性核酸酶，其好处是减少纯化bsai难度，同时保障bsai在分子克隆中的特异性。

12、进一步地，所述大肠杆菌top10菌株为top10(arabadc–)。

13、top10(arabadc–)为原核表达专用菌株，此菌株的阿拉伯糖操纵子被破坏，可用于阿拉伯糖诱导的原核表达。

14、进一步地，所述r.bsai基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述m.bsmai基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

15、进一步地，所述m.bsmai基因包含有3处bsai限制性内切酶识别以及切割位点，分别是agatcgagacc/tgaaagagacc/cgatcgagacc，用于bsai酶切电泳检测其甲基化保护的程度。

16、进一步地，所述m.bsmai基因的启动子为大肠杆菌deda的启动子，启动子下游接lac operator。m.bsmai的表达是受大肠杆菌阿拉伯糖操纵子控制，阿拉伯糖操纵子的核苷酸序列如seq id no:5所示。

17、本发明还提供采用上述bsai限制性内切酶的制备方法所制备的bsai限制性内切酶。

18、与现有技术相比，本发明构建的含有甲基转移酶m.bsmai的重组表达质粒可以同时保护bsai，bsmbi，bsmai酶识别位点，从而获得同时表达bsai，bsmbi，bsmai三种限制性内切酶的能力；此外，本发明提供的bsai限制性内切酶的制备方法流程简单，制备周期短，成本低，易于大规模生产制备，具有较好的产业化应用价值。

技术特征：

1.一种bsai限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述r.bsai基因克隆质粒pet-bsair的构建方法包括以下步骤：从pet质粒载体中去除t7启动子序列，将sphi-ndei处进行置换，置换序列如seq id no:6所示，将置换序列与r.bsai基因序列融合，选择酶切位点为5’sphi-3’xhoi，通过基因重组方式构建入所述pet质粒载体中。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌top10菌株的基因型为δ(mrr-hsdrms-mcrbc)或enda1。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌top10菌株为top10(arabadc–)。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述r.bsai基因的核苷酸序列如seq idno:1所示，所述m.bsmai基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述m.bsmai基因包含有3处bsai限制性内切酶识别以及切割位点。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述m.bsmai基因的启动子为大肠杆菌deda的启动子，启动子下游接lac operator。

8.一种bsai限制性内切酶，其特征在于，所述bsai限制性内切酶由权利要求1～7任一项所述的制备方法制得。

技术总结
本发明涉及一种BsaI限制性内切酶的制备方法，属于分子生物学技术领域。本发明通过密码子优化M.BsmAI基因的核苷酸序列，构建含有甲基转移酶M.BsmAI的BsaI重组表达质粒，然后选择简单易获得的大肠杆菌TOP10表达菌株进行诱导表达。本发明提供的BsaI限制性内切酶的制备方法流程简单，制备周期短，成本低，易于大规模生产制备，具有较好的产业化应用价值。

技术研发人员：王天武,何腾飞,郑毅,杨海霞,王栋,杨平
受保护的技术使用者：苏州泓迅生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/11