基于原核表达的嵌合PCV2中和表位的PCV3VLPs及其制备和应用

本发明涉及一种pcv3 vlps，具体涉及一种基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps及其制备和应用。

背景技术：

1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)为单链环状无囊膜dna病毒，属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)，是迄今为止发现的最小动物病毒之一。猪圆环病毒有三种血清型：猪圆环病毒1型(porcine circoviurs 1，pcv1)、猪圆环病毒2型(porcine circoviurs 2，pcv2)和猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3，pcv3)。其中，pcv2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(porcine multisystemic wasting syndrome，pmws)的主要病原之一，具有较强的致病性。pcv3是近年来新发现的一种能够引起仔猪消瘦、腹泻、关节肿胀、呼吸系统疾病及母猪繁殖障碍疾病的病毒，pcv3是单股环状的dna病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒粒子直径约17～20nm，无囊膜。pcv3与pcv2的cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，而cap蛋白是pcv诱导动物机体产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此pcv2疫苗对于pcv3所能提供的保护非常有限。

2、目前还没有pcv3商品化疫苗，猪圆环病毒vlps的制备也仅限于围绕pcv2展开，但临床已出现很多pcv2和pcv3混合感染的情况，单纯的pcv2vlps已不能防控临床出现的感染情况。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3vlps及其制备和应用，本发明制备的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps与野生型病毒外形相似性高，具备很好的免疫原性。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3vlps的制备方法，该制备方法包含：

3、(1)构建重组质粒pet-28a-cap3-cap2e

4、在如seq id no.2所示的pcv3 cap序列的5’端加入限制性内切酶bamhⅰ序列，将pcv2 cap的两个不同的中和表位序列seq id no.4～5以及限制性内切酶xhoⅰ序列添加到cap3序列的3’端，最终序列为seq id no.3，合成序列seq id no.3并克隆入pet-28a载体，得到重组质粒pet-28a-cap3-cap2e；

5、(2)重组载体原核表达

6、将所述重组质粒pet-28a-cap3-cap2e转化至表达感受态细胞中，挑取单克隆接种至培养基中，摇床过夜培养，得到重组蛋白表达菌pet-28a-cap3-cap2e/rosetta(de3)；将培养好的菌液接种于培养基中培养至od600为0.6时，加入iptg诱导表达；

7、(3)重组蛋白的纯化

8、离心收集菌体，蛋白缓冲液重悬，低温超声破碎进行处理，离心，收集上清，滤膜过滤，浓缩液使用凝胶过滤层析柱进行纯化；

9、(4)vlp的组装

10、将纯化完成的重组蛋白装入透析袋中，置于蛋白体积50倍的组装缓冲液中，4℃缓慢搅拌，中途换液若干次，透析结束后，收集透析袋里的液体，获得基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps。

11、优选地，所述表达感受态细胞选用rosetta(de3)。

12、优选地，所述重组载体原核表达中，培养基选用lb-k培养基。

13、优选地，所述摇床过夜培养条件为37℃、220r/min。

14、优选地，所述iptg的终浓度为1mmol/l，25℃诱导12h。

15、优选地，所述重组蛋白的纯化中，4℃、12000r/min离心20min；所述滤膜选用0.22μm的滤膜；所述蛋白缓冲液包含：tris、nacl和蒸馏水，ph为8.0，其中tris的浓度为2.42g/l，所述nacl的浓度为8.78g/l，该蛋白缓冲液经0.22μm的滤膜过滤。

16、优选地，所述凝胶过滤层析柱进行纯化，包含：

17、(1)将层析柱superdextm20016/600连于管路上，使用蛋白缓冲液洗2cv用于平衡层析柱，设置流速为1ml/min；

18、(2)将蛋白样品注入到1ml loop环中，设置洗脱流速为1ml/min，用蛋白缓冲液洗脱蛋白，每1ml固定体积收集，直至uv280达到基线；

19、(3)蛋白纯化完成后，使用ddh2o洗2cv至uv280和电导值达到基线，20％乙醇洗1cv，拆柱子，4℃保存；

20、(4)对收集的各组分进行sds-page检测。

21、优选地，所述vlp的组装中，4℃缓慢搅拌48h，中途进行3次换液；所述组装缓冲液包含：100mmol/lnah2po4、0.5mol/lnacl、100mmol/lkcl、10mmol/l tris-hcl、0.5％tritonx-100和0.1mmol/l pmsf(即苯甲基磺酰氟)，ph为7.4。

22、本发明的另一目的是提供所述的制备方法获得的基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps。

23、本发明的另一目的是提供所述的基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。

24、本发明的基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps及其制备和应用，具有以下优点：

25、本发明将pcv2中和表位连接到了pcv3 cap上，并进行了针对大肠杆菌表达系统的密码子优化，成功表达出了蛋白并制备出了vlps。通过电镜观察到，制备的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps与野生型病毒外形相似性高；通过免疫试验证明，具备很好的免疫原性。

技术特征：

1.一种基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达感受态细胞选用rosetta(de3)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体原核表达中，培养基选用lb-k培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述摇床过夜培养条件为37℃、220r/min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述iptg的终浓度为1mmol/l，25℃诱导12h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白的纯化中，4℃、12000r/min离心20min；所述滤膜选用0.22μm的滤膜；所述蛋白缓冲液包含：tris、nacl和蒸馏水，ph为8.0，其中tris的浓度为2.42g/l，所述nacl的浓度为8.78g/l，该蛋白缓冲液经0.22μm的滤膜过滤。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析柱进行纯化，包含：

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述vlp的组装中，4℃缓慢搅拌48h，中途进行3次换液；所述组装缓冲液包含：100mmol/lnah2po4、0.5mol/lnacl、100mmol/lkcl、10mmol/ltris-hcl、0.5％triton x-100和0.1mmol/l pmsf，ph为7.4。

9.如权利要求1～8任意一项所述的制备方法获得的基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps。

10.如权利要求9所述的基于原核表达的嵌合pcv2中和表位的pcv3 vlps在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于原核表达的嵌合PCV2中和表位的PCV3VLPs及其制备和应用，该制备方法包含：(1)构建重组质粒pET‑28a‑Cap3‑Cap2E：在如SEQ ID NO.2所示的PCV3Cap序列的5’端加入限制性内切酶BamHⅠ序列，将PCV2Cap的两个不同的中和表位序列以及限制性内切酶XhoⅠ序列添加到cap3序列的3’端，合成序列并克隆入pET‑28a载体，得到重组质粒；(2)重组载体原核表达；(3)重组蛋白的纯化；(4)VLP的组装。本发明制备的嵌合PCV2中和表位的PCV3VLPs与野生型病毒外形相似性高，具备很好的免疫原性。

技术研发人员：武星辰,马海利,王琪凯,罗小毛,梁立滨,高诗敏
受保护的技术使用者：山西农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/9