一种水稻早熟性状的KASP分子标记的检测引物对及检测方法和应用与流程

本发明属于分子育种，具体涉及一种水稻早熟性状的kasp分子标记的检测引物对及检测方法和应用。

背景技术：

1、水稻生育期历来是水稻育种中一个非常重要的性状，一方面影响该品种对光温利用效率和增产潜力，另一方面影响该品种在不同地区和季节的推广潜力。通过育种方法改变各类水稻的生育期，特别是缩短品种的生育期，不论是过去和将来，都对水稻生产发展具有十分重要的意义。

2、水稻抽穗期相关基因hd17定位在水稻第6染色体p548d347和0007o20标记中的328kb范围内，hd17编码一个co-like蛋白，与拟南芥中elf3蛋白的编码基因同源。hd17的自然变异可能改变了开花抑制因子ghd7的表达水平，说明hd17是水稻光周期开花途径中的一个组成部分。

3、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的dna序列多态性。snp标记具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量分型的特点，很多等位基因的功能变异均被发现与snp有关，因此，snp标记在品种鉴定和育种利用中具有较好前景。适用于snp检测的方法主要有凝胶电泳、荧光定量pcr、snp芯片和竞争性等位基因pcr(kompetitiveallele specific pcr，kasp)。kasp技术现已成为snp分型检测的主要方法之一，其基本程序是：利用带有2种通用标签与2条正向引物和1条反向引物结合、带有不同荧光信号的2条检测引物mastermix，经3次pcr反应进行snp位点荧光检测：pcr反应i：dna模板变性，与kasp引物结合，退火延伸后，选择合适的引物的序列；pcr反应ii：末端序列的互补链；pcr反应iii：特异序列随pcr反应进行指数性增长，荧光信号产生并被检测。因此一台实时荧光定量pcr仪即可对荧光信号进行检测。该技术具有高度的稳定性与准确性。kasp的基因分型方法是通过计算pcr过程中产生的荧光信号，实现对变异位点的检测，检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害。相比于dna芯片技术，利用kasp技术进行snp检测的成本较低，其成本与检测的snp位点数呈正相关。因此，基于kasp技术开发snp标记进行品种鉴定，可大大提高鉴定效率，是具有重要意义的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种水稻早熟性状的kasp分子标记的检测引物对及检测方法和应用，所述kasp分子标记与hd17基因共分离，可在早籼稻中快速、精准的检测hd17，用于早熟早籼稻新品种选育。

2、本发明提供了一种水稻早熟性状的kasp分子标记的检测引物对，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的引物x、核苷酸序列如seq id no.2所示的引物y和核苷酸序列如seqid no.3所示的引物c。

3、优选的，在所述引物y和引物c分别包含不同的荧光接头。

4、优选的，所述荧光接头包括fam荧光接头和vic荧光接头。

5、本发明提供了一种检测试剂，包括上述检测引物对。

6、本发明提供了一种检测试剂盒，包括上述检测试剂或上述检测引物对。

7、本发明提供了一种检测水稻早熟性状的方法，包括以下步骤：提取水稻基因组dna为模板，利用上述检测引物对进行pcr，pcr产物具有与引物y相同的荧光信号，说明所述水稻具有早熟性状。

8、优选的，所述pcr扩增反应体系以10μl计，包括：2×kasp mastermix 5μl，100μmkasp primermix 0.75μl，模板dna 1.0μl，ddh2o 3.25μl。

9、优选的，所述pcr的程序，包括：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

10、本发明还提供了上述检测引物对或上述检测试剂或上述检测试剂盒或上述方法在水稻早熟性状检测中的应用。

11、本发明还提供了上述检测引物对或上述检测试剂或上述检测试剂盒或上述方法在水稻育种中的应用。

12、有益效果：本发明提供了一种水稻早熟性状的kasp分子标记的检测引物对，可用于检测水稻生育期基因hd17位点。本发明开发的kasp分子标记与hd17基因共分离，可在早籼稻中快速、精准的检测生育期相关基因hd17。本发明开发的kasp分子标记检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害，而且检测成本较低，适宜于高通量商业化检测。本发明所述的检测引物对和检测方法，可在苗期即可进行选择，减小育种群体的大田种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。

技术特征：

1.一种水稻早熟性状的kasp分子标记的检测引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的引物x、核苷酸序列如seq id no.2所示的引物y和核苷酸序列如seq idno.3所示的引物c。

2.根据权利要求1所述检测引物对，其特征在于，在所述引物y和引物c分别包含不同的荧光接头。

3.根据权利要求2所述检测引物对，其特征在于，所述荧光接头包括fam荧光接头和vic荧光接头。

4.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述检测引物对。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述检测试剂或权利要求1～3任一项所述检测引物对。

6.一种检测水稻早熟性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取水稻基因组dna为模板，利用权利要求1～3任一项所述检测引物对进行pcr，pcr产物具有与引物y相同的荧光信号，说明所述水稻具有早熟性状。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述pcr的扩增反应体系以10μl计，包括：2×kasp mastermix 5μl，100μm kasp primermix 0.75μl，模板dna 1.0μl，ddh2o 3.25μl。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述pcr的程序，包括：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

9.权利要求1～3任一项所述检测引物对或权利要求4所述检测试剂或权利要求5所述检测试剂盒或权利要求6～8任一项所述方法在水稻早熟性状检测中的应用。

10.权利要求1～3任一项所述检测引物对或权利要求4所述检测试剂或权利要求5所述检测试剂盒或权利要求6～8任一项所述方法在水稻育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种水稻早熟性状的KASP分子标记的检测引物对及检测方法和应用，属于分子育种技术领域。本发明提供了一种水稻早熟性状的KASP分子标记的检测引物对，可用于检测水稻生育期基因Hd17位点。本发明开发的KASP分子标记与Hd17基因共分离，可在早籼稻中快速、精准的检测生育期相关基因Hd17。本发明开发的KASP分子标记检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害，而且检测成本较低，适宜于高通量商业化检测。本发明所述的检测引物对和检测方法，可在苗期即可进行选择，减小育种群体的大田种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。

技术研发人员：施贤波,姜洁锋,金林灿,应泉盛,严成其,黄宣,毕继安
受保护的技术使用者：宁波市农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/27