一种快速特异性逆转录试剂及其使用方法与流程

本申请涉及分子生物，具体涉及一种快速特异性逆转录试剂及其使用方法。

背景技术：

1、在临床诊断中检测基因表达量、病毒感染等，都需要用到rna作为模板进行检测。但rna不能直接扩增，需要先进行逆转录成为cdna。用组织细胞提取mrna为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cdna，再进行下游应用，是在基因工程技术中最常用的检测目的基因的方法。通常逆转录都使用oligo(dt)或随机引物将总rna进行逆转。根据不同的情况选择不同的反转录引物，如果要检测的rna有poly a尾巴，可以用oligo(dt)做反转录引物；如果要检测的rna没有poly a尾巴，就用随机引物来反转。

2、但对于靶基因检测来说，有大量的非靶基因被逆转录，影响了效率和产量。因此，需要有高效率和高产量的快速逆转录靶基因rna的反应体系。用特定引物来逆转，可以充分利用反应中的原料，高效产生靶基因的cdna。

3、目前商业化逆转录试剂盒的反应体系都是适用于oligo(dt)或随机引物。对于特定引物逆转录需要有优化的试剂和条件，从而可能使反应快速高效的进行。

4、因此，需要有高效率逆转录样品中的靶rna，并进行检测的方法。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种快速逆转录反应体系，能够特异性地逆转录样品中靶基因rna。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种利于快速逆转录反应的扩增试剂，包括缓冲液、dntps、单价阳离子、二价阳离子、添加剂；所述缓冲液为tris缓冲液，ph为8.0～8.5，所述缓冲液的工作浓度为20～50mm，所述单价阳离子为k+，所述二价阳离子为二价阳离子为mg2+或mn2+，所述二价阳离子的工作浓度为2～3mm；所述dntp的工作浓度为0.15～0.3mm；所述添加剂为300～500μg/ml牛血清蛋白或0～400mm 2-吡咯烷酮。

3、本申请第二方面提供一种利于快速逆转录反应的试剂盒，包括前述的扩增试剂、逆转录酶、rna酶抑制剂和引物。

4、在本申请的任意实施例中，逆转录酶和rna酶抑制剂的体积比为1:1～2:1。

5、在本申请的任意实施例中，逆转录酶的工作浓度为0.2～0.3u/μl。

6、在本申请的任意实施例中，引物长度为18-25bp，gc含量为30-80％。

7、在本申请的任意实施例中，引物扩增得到的产物片段长度为50～150bp。

8、在本申请的任意实施例中，引物的工作浓度为200～500nm。

9、在本申请的任意实施例中，引物的序列如seq id no.1、seq id no.2、seq idno.4、seq id no.5所示。

10、本申请第三方面提供一种利用前述的试剂盒进行逆转录的方法，包括将rna与扩增试剂、逆转录酶、rna酶抑制剂和引物混匀，进行逆转录反应，得到产物cdna。

11、在本申请的任意实施例中，逆转录反应时，反应体系如下：

12、

13、在本申请的任意实施例中，逆转录反应的体系为10～50μl。

14、在本申请的任意实施例中，逆转录反应的温度为37～60℃；所述逆转录反应的时间不超过10min。

15、本申请第四方面提供前述的扩增试剂、前述的试剂盒、或前述的方法在逆转录反应或制备疾病诊断产品中的用途。

16、与现有技术相比，本申请的有益效果为：

17、本申请的反应体系适用于特异性的逆转录靶rna为cdna，节约资源，提高产量。本申请的逆转录温度高，可以显著降低非特异性逆转录。逆转录时间短，提高效率，从而高效逆转录靶rna。

技术特征：

1.一种利于快速逆转录反应的扩增试剂，包括缓冲液、dntps、单价阳离子、二价阳离子、添加剂；所述缓冲液为tris缓冲液，ph为8.0～8.5，所述缓冲液的工作浓度为20～50mm，所述单价阳离子为k+，所述二价阳离子为二价阳离子为mg2+或mn2+，所述二价阳离子的工作浓度为2～3mm；所述dntp的工作浓度为0.15～0.3mm；所述添加剂为300～500μg/ml牛血清蛋白和0～400mm 2-吡咯烷酮。

2.一种利于快速逆转录反应的试剂盒，包括如权利要求1所述的扩增试剂、逆转录酶、rna酶抑制剂和引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶和rna酶抑制剂的体积比为1:1～2:1。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶的工作浓度为0.2～0.3u/μl。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物长度为18～25bp，gc含量为30-80％；和/或，所述引物扩增得到的产物片段长度为50～150bp；

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如seq id no.1、seqidno.2、seq id no.4、seq id no.5所示。

7.一种利用如权利要求2～6任一所述的试剂盒进行逆转录的方法，包括将rna与扩增试剂、逆转录酶、rna酶抑制剂和引物混匀，进行逆转录反应，得到产物cdna。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，逆转录反应时，反应体系如下：

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应的体系为10～50μl；

10.如权利要求1所述的扩增试剂、如权利要求2～6任一所述的试剂盒、或如权利要求7～9任一所述的方法在逆转录反应或制备疾病诊断产品中的用途。

技术总结
本申请涉及分子生物技术领域，具体涉及一种快速特异性逆转录试剂及其使用方法。本申请提供一种利于快速逆转录反应的扩增试剂，包括缓冲液、dNTPs、单价阳离子、二价阳离子、添加剂；所述缓冲液为Tris缓冲液，pH为8.0～8.5，所述缓冲液的工作浓度为20～50mM，所述单价阳离子为K+，所述二价阳离子为二价阳离子为Mg2+或Mn2+，所述二价阳离子的工作浓度为2～3mM；所述dNTP的工作浓度为0.15～0.3mM；所述添加剂为300～500μg/mL牛血清蛋白和0～400mM 2‑吡咯烷酮。本发明中反应体系适用于特异性的逆转录靶RNA为cDNA，节约资源，提高产量。逆转录温度高，可以显著降低非特异性逆转录。逆转录时间短，提高效率。

技术研发人员：葛明华,李雯,郑传铭,石涵,杨峰,蒙琪琪,郭振英
受保护的技术使用者：浙江省人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/6/20