一种HBV剪接变异体特异性蛋白的单克隆抗体及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种hbv剪接变异体特异性蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)是一种部分双链环状的dna病毒，属于嗜肝dna病毒科。hbv持续感染所致的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b，chb)是肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)发生发展的最重要病因。中国是乙型肝炎高发国家，约有1.15亿人携带hbv，约占全球hbv患者总数的1/3，其中约有3000万为chb患者。hbv感染的持续性存在或感染慢性化是造成肝细胞炎症坏死持续性存在的最主要的原因，因此，有效控制hbv持续性感染和慢性化成为预防和治疗肝癌的关键。

2、hbv也是一种具有反转录过程的dna病毒，由hbv的前基因组rna(pre-genomicrna，pgrna)通过特定位点上的rna剪接并反转录可形成基因组部分缺失的hbv dna，即hbv基因组剪接变异体(splicedvariants ofhepatitis b virus genomes)，它们可编码一些特殊的剪接变异体蛋白。其中，双剪接型2.2kb hbv基因组剪接变异体在2447nt～2935nt及3018nt～489nt位点发生剪接。已证实其在肝癌组织中的检出率高于癌旁组织，且能增加野生型hbv在体外的复制。

3、双剪接型2.2kb hbv基因组剪接变异体可编码大小为139个氨基酸的剪接特异性蛋白，称为hbdsp(hepatitis b doubly spliced protein)。hbdsp是一种多效激活蛋白，主要定位在细胞质、高尔基体和内质网，可通过ap-1或c/ebp结合位点发挥反式激活作用，引起宿主细胞内的多种致癌基因及hbv自身基因的异常表达，从而参与hbv的致病过程。此外，hbdsp还可通过ets1/gata2/yy1介导的p53转录促进野生型p53的肝癌细胞凋亡，并增加hbv后代和病毒抗原的产生。因此，hbdsp可能作为新的病毒致病因子参与肝癌的发生发展，并在hbv导致chb的致病机制中发挥重要作用。

4、因此，本领域的技术人员致力于开发一种特异性单克隆抗体能够准确识别并结合hbdsp。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种能够准确识别并结合hbdsp的特异性单克隆抗体。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种单克隆抗体，包括抗原识别肽的剪接供受体位点，抗原识别肽的剪接供受体表位是：lgnlnldpaf。

3、本发明还提供了一种单克隆抗体在识别并结合hbdsp蛋白的应用。

4、进一步地，蛋白hbdsp的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步地，包括以下步骤：

6、步骤1、制备含有hbdsp蛋白的重组载体；

7、步骤2、在细胞株中过表达步骤1得到的重组载体；

8、步骤3、用单克隆抗体检测步骤2过表达的情况。

9、进一步地，步骤1中重组载体为pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag(简称为phouge-hbdsp)重组载体。

10、进一步地，pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag(简称为phouge-hbdsp)重组载体的制备方法为：以双剪接型hbv剪接变异体的基因组为克隆模板，克隆得到从聚合酶起始密码子开始的预测翻译将产生含有139个氨基酸的hbdsp产物，将其构建在pcdh-ef1-mcs-t2a-puro(简称为phouge)载体上，形成pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag(简称为phouge-hbdsp)重组载体。

11、进一步地，双剪接型hbv剪接变异体的核苷酸序列如seq id no.2所示。

12、进一步地，步骤2中细胞株包括：hepg2和/或huh7。

13、进一步地，步骤3还包括用单克隆抗体在hbv阳性细胞中检测hbdsp的表达。

14、进一步地，hbv阳性细胞包括hepg2.2.15细胞、hepad38细胞和/或hbv感染的hepg2-ntcp细胞。

15、进一步地，通过利用双剪接型2.2kb hbv基因组剪接变异体的剪接供体-受体位点，创新性地设计了抗原识别肽，随后交由公司进行单克隆抗体的制备。制备了能够特异性识别并结合hbdsp的单克隆抗体。

16、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明制备pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag(简称为phouge-hbdsp)重组载体的过程；

17、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明单克隆抗体检测细胞株中过表达的hbdsp；

18、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明单克隆抗体检测整合了hbv基因组的细胞系中hbdsp的表达。

19、本申请有益的技术效果如下：

20、本申请通过利用双剪接型2.2kb hbv基因组剪接变异体的剪接供受体位点设计了抗原识别肽并制备了能够准确识别并结合hbdsp的特异性单克隆抗体，并利用该抗体能够在hbv阳性的肝癌细胞株中(hepg2.2.15、hepad28及hbv感染的hepg2-ntcp)检测到hbdsp的表达。特异性单克隆抗体的制备提高了对hbdsp的检测特异性和灵敏度。实现了对hbv基因组剪接变异体的精准标识。

21、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗原识别肽的剪接供受体位点，所述抗原识别肽的剪接供受体表位是：lgnlnldpaf。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在识别并结合hbdsp蛋白的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述hbdsp蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述重组载体为pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag重组载体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag重组载体的制备方法为：以双剪接型hbv剪接变异体的基因组为克隆模板，克隆得到从聚合酶起始密码子开始的预测翻译将产生含有139个氨基酸的hbdsp产物，将所述hbdsp产物的基因序列构建在pcdh-ef1-mcs-t2a-puro载体上，形成所述pcdh-ef1-mcs-t2a-puro-hbdsp-flag重组载体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双剪接型hbv剪接变异体的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述细胞株包括：hepg2和/或huh7。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括用所述单克隆抗体在hbv阳性细胞中检测所述hbdsp的表达。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述hbv阳性细胞包括hepg2.2.15细胞、hepad38细胞和/或hbv感染的hepg2-ntcp细胞。

技术总结
本发明公开了一种HBV剪接变异体特异性蛋白的单克隆抗体及其应用，涉及生物技术领域。该单克隆抗体的抗原识别肽的剪接供受体表位是：LGNLNLDPAF。该单克隆抗体应用于识别并结合蛋白HBDSP。本发明特异性单克隆抗体能检测到HBDSP的表达，提高了对HBDSP的检测特异性和灵敏度。实现了对HBV基因组剪接变异体的精准标识。

技术研发人员：陈婉南,林旭,徐霞贞,张璐
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/6/20