一种速效的农杆菌介导的鸢尾花粉遗传转化方法

本发明属于农业生物和植物基因工程领域，具体涉及一种农杆菌介导的鸢尾花粉转化方法。

背景技术：

1、鸢尾是鸢尾科鸢尾属的多年生草本植物，多分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古及云南地区，具有极高的耐寒性。鸢尾花主要色彩为蓝紫色，有“蓝色妖姬”的美誉，因其花瓣形如鸢鸟尾巴而得名。鸢尾花叶片碧绿青翠，花形大而奇，宛若翩翩彩蝶，是庭院中的重要花卉之一，也是优美的盆花、切花和花坛用花。其花色丰富、花型奇特是花坛及庭院绿化的良好材料，也可用作地被植物，有些种类甚至为优良的鲜切花材料。随着生活水平和审美的提高，人们对鸢尾花品质改良的需求也越来越紧迫，传统鸢尾花杂交育种周期长、见效慢，严重影响了鸢尾花新品种的培育。目前，采用基因工程技术获得新品种是最高效的育种方式之一，但国内外对于鸢尾花的转基因技术报道极为缺少，尚未发表鸢尾花粉转基因研究的文章。

2、1983年，中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所周光宇教授首次成功地将外源海岛棉dna导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道法，但未能得到分子水平上的验证和明确的基因表达产物，使这一方法无法应用到转基因植物中。随后，luo等人于1988年首次报道用花粉管通道法将含报告基因的质粒dna转入水稻，经southern杂交和酶学测定证明，得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株，证明花粉管通道法的转化工作能够像其它直接转化法一样，完全按转基因技术的操作进行。近年来，花粉管通道法已在多种作物中获得成功，因其独特的优势，被科学家们广泛的利用，进行植株的转基因操作。该方法有以下几个优点：首先，花粉管通道法应用范围较广，可应用于任何开花植物，并能在不同物种之间进行不同基因的转移，因此放宽了目的基因和受体植株的范围；第二，该方法不依赖于繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的过程，花粉管道方法利用自然的繁殖过程直接获取转基因种子，简单快捷；第三，该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度，在当年即可收获转基因种子，并进行检测；第四，操作简捷，技术易掌握，不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。

技术实现思路

1、针对上述领域中的需求，本发明提供了一种鸢尾花粉遗传转化方法，避免了传统遗传转化方法中的缺点，建立了一种高效快速的农杆菌介导鸢尾花粉的遗传转化方法。

2、一种快速高效农杆菌介导的鸢尾花粉遗传转化方法，包含以下步骤：

3、(1)选取茎干健壮、叶片无病虫害、花朵饱满未完全绽放的植株，于早上9点对其进行去雄，套袋；

4、(2)调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度，离心收集菌株，使用mss重悬液重悬菌株，室温静止3h；

5、(3)收集花朵刚绽放花药未炸开时的花粉，将花粉转移至去雄花朵的柱头上，使用1ml注射器注射农杆菌mss重悬液至含有花粉的柱头，用手指轻轻摩挲柱头，使花药充分浸泡在重悬液中，套密封遮光袋静置30min；

6、(4)授粉8h后，使用注射器吸取重悬液注射花粉管，使用密封遮光袋避光3d，然后去除遮光袋，使用授粉袋套袋，支架绑在处理植株上，避免倒伏；

7、(5)秋天收取种子后，使用mh液体培养基进行筛选培养，进行转基因植株鉴定。

8、所述步骤(1)(3)中的花朵和花粉为成熟的玉蝉花朵和花粉。

9、所述步骤(2)中的mss重悬液为ms+sugar+silwet l-77液体培养基。

10、所述步骤(5)中的mh液体培养基为ms+hyg培养基。

11、本发明实施例中所述重悬液中农杆菌菌液od600为1.5-1.8。

12、本发明实施例中所述重悬液中加入表面活性剂(silwet l-77)和糖，筛选培养基中加入潮霉素(hygr omycin，hyg)。

13、本发明实施例中所述的生物工程菌为农杆菌gv3101；目标载体为携带溪荪转录因子ismyb75及筛选报告基因gfp的植物表达载体pcambia1300-gfp。

14、本发明实施例中所述转基因植株鉴定方法为pcr分析，筛选pcr扩增阳性的鸢尾花植株。

15、本发明实施例中所述的鸢尾花品种为野生型玉蝉花。

16、本发明以鸢尾成熟花粉为材料，以去雄花柱为受体，以花粉管注射为辅；利用农杆菌介导，将外源基因导入鸢尾基因组，从而获得转基因鸢尾。

17、本发明无需经过组织培养，直接用花粉进行操作，具有以下优点：

18、(1)应用范围较广，可应用于任何开花植物，并能在不同物种之间进行不同基因的转移，因此放宽了目的基因和受体植株的范围。

19、(2)该方法不依赖于繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的过程，花粉管道方法利用自然的繁殖过程直接获取转基因种子，简单快捷。

20、(3)该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度，在当年即可收获转基因种子，并进行检测。

21、(4)操作简捷，技术易掌握，不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。

技术特征：

1.一种速效的农杆菌介导的鸢尾花粉遗传转化方法，包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，所述的生物工程菌为农杆菌gv3101，目标载体为携带溪荪转录因子ismyb75及筛选报告基因gfp的植物表达载体pcambia1300-gfp。

3.根据权利要求2所述的方法，所述转基因植株鉴定方法为qpcr和pcr分析，筛选有pcr扩增阳性的鸢尾花植株。

4.根据权利要求1所述的方法，所述的鸢尾花品种为野生型玉蝉花。

技术总结
本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，公开了一种速效的农杆菌介导的鸢尾花粉遗传转化方法。该方法的主要步骤包括：选取茎干健壮、叶片无病虫害、花朵饱满未完全绽放的植株，于早上9点对其进行去雄，套袋；调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度，离心收集菌株，使用MSS重悬液重悬菌株，室温静止3h；收集花朵刚绽放花药未炸开时的花粉，将花粉转移至去雄花朵的柱头上，使用1ml注射器注射农杆菌MSS重悬液至含有花粉的柱头，用手指轻轻摩挲柱头，使花药充分浸泡在重悬液中，套密封遮光袋静置30min；授粉8h后，使用注射器吸取重悬液注射花粉管，使用密封遮光袋避光3d，然后去除遮光袋，使用授粉袋套袋，支架绑在处理植株上，避免倒伏；秋天收取种子后，使用MH液体培养基进行筛选培养，进行转基因植株鉴定。

技术研发人员：王玲,刘会君,尹守东,范丽娟,史恭发
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/29